La proteinuria patologica è uno dei segni più importanti e permanenti delle malattie del tratto renale e delle vie urinarie. La determinazione della concentrazione di proteine ​​nelle urine è un elemento essenziale e importante del test delle urine. Identificazione e quantificazione di proteinuria è importante non solo nella diagnosi di molte malattie renali primari e secondari, la valutazione della gravità delle alterazioni proteinuria nelle dinamiche trasporta informazioni sul corso del processo patologico, l'efficacia del trattamento. La rilevazione di proteine ​​nelle urine, anche in tracce, dovrebbe essere allarmante per possibili malattie renali o del tratto urinario e richiede una nuova analisi. Di particolare rilievo è l'insensatezza del test delle urine e, in particolare, la determinazione delle proteine ​​urinarie senza rispettare tutte le regole per la sua raccolta.

Tutti i metodi per determinare le proteine ​​nelle urine possono essere suddivisi in:

• qualità,
• semiquantitativa,
• Quantitativa.

Metodi qualitativi

Tutti i campioni di proteine ​​delle urine di alta qualità si basano sulla capacità delle proteine ​​di denaturare sotto l'influenza di vari fattori fisici e chimici. In presenza di proteine ​​nel campione di urina, c'è o torbidità o perdita di sedimento flocculante.

Condizioni per la determinazione delle proteine ​​nelle urine in base alla reazione di coagulazione:

1. L'urina dovrebbe essere acida. L'urina alcalina viene acidificata con diverse (2-3) gocce di acido acetico (5-10%).
2. L'urina dovrebbe essere chiara. La torbidità viene eliminata attraverso un filtro di carta. Se la torbidità non scompare, aggiungere talco o magnesia bruciata (circa 1 cucchiaino per 100 ml di urina), agitare e filtrare.
3. Il test qualitativo deve essere effettuato in due provette, una delle quali: il controllo.
4. La ricerca della torbidità dovrebbe essere su uno sfondo nero nella luce trasmessa.

I metodi qualitativi per determinare la proteina nelle urine includono:

Come dimostrato da numerosi studi, nessuno dei numerosi metodi noti per la determinazione qualitativa delle proteine ​​nelle urine consente di ottenere risultati affidabili e riproducibili. Nonostante ciò, nella maggior parte dei CDL in Russia, questi metodi sono ampiamente utilizzati come screening - nelle urine con una risposta qualitativa positiva, la quantificazione delle proteine ​​viene ulteriormente eseguita. Delle reazioni qualitative, un test di Geller e un campione con acido solfosalicilico sono più comunemente utilizzati, tuttavia, un campione con acido solfosalicilico è per lo più considerato il più adatto per la rilevazione di proteinuria patologica. Il test di ebollizione è attualmente praticamente non utilizzato a causa della sua laboriosità e durata.

Metodi semiquantitativi

Il metodo Brandberg-Roberts-Stolnikov si basa sul test dell'anello di Geller, quindi con questo metodo si osservano gli stessi errori del test di Geller.

Attualmente, le strisce diagnostiche sono sempre più utilizzate per determinare le proteine ​​delle urine. Per la determinazione semiquantitativa della proteina nelle urine su una striscia, il colorante più comunemente utilizzato è il blu di bromofenolo nel tampone citrato. Il contenuto proteico nelle urine è giudicato dall'intensità del colore blu-verde, che si sviluppa dopo il contatto della zona di reazione con l'urina. Il risultato è valutato visivamente o utilizzando analizzatori di urina. Nonostante la grande popolarità e gli evidenti vantaggi dei metodi di chimica secca (semplicità, velocità di analisi), questi metodi di analisi delle urine in generale e di determinazione delle proteine ​​in particolare non sono privi di gravi difetti. Uno di questi, che porta a una distorsione delle informazioni diagnostiche, è la maggiore sensibilità del bromofenolo indicatore blu all'albumina in confronto con altre proteine. A questo proposito, le strisce reattive sono adattate principalmente alla rilevazione della proteinuria glomerulare selettiva, quando quasi tutta la proteina urinaria è rappresentata dall'albumina. Con la progressione dei cambiamenti e la transizione della proteinuria glomerulare selettiva a non selettiva (la comparsa di globuline nelle urine), i risultati della determinazione delle proteine ​​sono sottostimati rispetto ai valori reali. Questo fatto rende impossibile utilizzare questo metodo per determinare la proteina nelle urine per valutare lo stato dei reni (filtro glomerulare) nel tempo. Nella proteinuria tubulare, anche i risultati della determinazione delle proteine ​​sono sottostimati. La determinazione della proteina mediante strisce diagnostiche non è un indicatore affidabile di bassi livelli di proteinuria (la maggior parte delle strisce diagnostiche attualmente disponibili non ha la capacità di catturare proteine ​​nelle urine ad una concentrazione inferiore a 0,15 g / l). Risultati negativi della determinazione delle proteine ​​su strisce non escludono la presenza nelle urine di globuline, emoglobina, uromucoi, proteina Bens-Jones e altre paraproteine.

Fiocchi glicoproteine ​​muco ad elevato contenuto (ad esempio, nei processi infiammatori del tratto urinario, piuria, batteriuria) possono depositarsi sulla superficie di visualizzazione del nastro e portare a risultati falsi positivi. Risultati falsi positivi possono anche essere associati a un'alta concentrazione di urea. Una scarsa illuminazione e una scarsa percezione dei colori possono causare risultati inaccurati.

A questo proposito, l'uso di strisce diagnostiche dovrebbe essere limitato alle procedure di screening e i risultati ottenuti con il loro aiuto dovrebbero essere considerati solo come indicativi.

Metodi quantitativi

La corretta determinazione quantitativa delle proteine ​​nelle urine in alcuni casi non è un compito facile. Le difficoltà della sua soluzione sono determinate dal seguente numero di fattori:

• basso contenuto proteico nelle urine di una persona sana, spesso sulla soglia di sensibilità dei metodi più noti;
• la presenza nell'urina di molti composti che possono interferire con il corso delle reazioni chimiche;
• fluttuazioni significative nel contenuto e nella composizione delle proteine ​​delle urine in varie malattie che rendono difficile scegliere un materiale di calibrazione adeguato.

Nei laboratori clinici vengono utilizzati prevalentemente i cosiddetti metodi "di routine" per determinare la proteina nelle urine, ma non sempre forniscono risultati soddisfacenti.

Dal punto di vista di un analista specializzato che lavora in laboratorio, il metodo inteso per la determinazione quantitativa delle proteine ​​delle urine deve soddisfare i seguenti requisiti:

• avere una relazione lineare tra l'assorbimento del complesso formato durante la reazione chimica e il contenuto di proteine ​​nel campione in un'ampia gamma di concentrazioni, evitando così operazioni aggiuntive nella preparazione del campione per lo studio;
• dovrebbe essere semplice, non richiedere l'esecutore altamente qualificato, essere eseguito con un numero limitato di operazioni;
• avere alta sensibilità, affidabilità analitica quando si utilizzano piccole quantità del materiale studiato;
• essere resistente a vari fattori (variazioni nella composizione del campione, presenza di droghe, ecc.);
• avere un costo accettabile;
• essere facilmente adattabile agli analizzatori automatici;
• il risultato della determinazione non dovrebbe dipendere dalla composizione proteica del campione di urina.

Nessuno dei metodi attualmente noti per la determinazione quantitativa delle proteine ​​nelle urine può affermare pienamente di essere il "gold standard".

I metodi quantitativi per determinare la proteina nelle urine possono essere suddivisi in turbidimetrici e colorimetrici.

Metodi turbidimetrici

I metodi turbidimetrici includono:

• determinazione delle proteine ​​con acido sulfosalicilico (SSC),
• determinazione delle proteine ​​con acido tricloroacetico (THC),
• determinazione delle proteine ​​con benzonio cloruro.

I metodi turbidimetrici si basano sulla riduzione della solubilità delle proteine ​​urinarie dovuta alla formazione di una sospensione di particelle sospese sotto l'influenza di agenti precipitanti. Sul contenuto proteico nel campione di prova è giudicato mediante intensità di diffusione della luce definita dal numero di particelle di dispersione della luce (metodo dell'analisi nefelometrica), o indebolendo la sospensione formatasi flusso luminoso (metodo di dosaggio turbidimetrico).

L'entità di metodi di dispersione della luce di proteine ​​pretsipitatsionnyh nella rilevazione urine dipende da una serie di fattori: velocità di miscelazione dei reagenti, la temperatura di reazione, il valore pH del mezzo, presenza di altri composti, metodi fotometria. L'attenta aderenza alle condizioni di reazione contribuisce alla formazione di una sospensione stabile con una dimensione delle particelle costante e al raggiungimento di risultati relativamente riproducibili.

Alcuni farmaci influenzano i risultati dei metodi turbidimetrici per la determinazione delle proteine ​​nelle urine, portando ai cosiddetti risultati "falsi positivi" o "falsi negativi". Questi includono alcuni antibiotici (benzilpenicillina, cloxacillina, ecc.), Sostanze contenenti iodio radiopaco, farmaci sulfa.

I metodi turbidimetrici sono scarsamente standardizzati, spesso portando a risultati errati, ma nonostante questo, sono ora ampiamente utilizzati nei laboratori a causa del basso costo e della disponibilità dei reagenti. Il metodo più utilizzato in Russia è la determinazione delle proteine ​​con acido sulfosalicilico.

Metodi colorimetrici

I più sensibili e accurati sono i metodi colorimetrici per determinare le proteine ​​totali delle urine, sulla base di specifiche reazioni delle proteine ​​del colore.

Questi includono:

1. reazione del biureto,
2. Metodo Lowry
3. metodi basati sulla capacità di vari coloranti di formare complessi con proteine:
   • Ponceau S (Ponceau S),
   • Coomassie Brilliant Blue Coomassie Brilliant Blue
   • Rosso pirogallolo.

Dal punto di vista del performer, nel lavoro quotidiano del laboratorio con un ampio flusso di ricerca, il metodo biuret è scomodo a causa del gran numero di operazioni. Allo stesso tempo, il metodo caratterizzato da analitico elevata affidabilità, consente di determinare le concentrazioni di proteine ​​in una vasta gamma e rilevare albumina, globuline e paraproteine ​​con sensibilità paragonabile, per cui metodo del biureto è considerato come riferimento per il confronto e raccomandare altri metodi analitici di rilevazione di proteine ​​nell'urina. Metodo biureto per la determinazione delle proteine ​​nell'urina viene preferibilmente effettuata in laboratori, uffici serve nefrologico e utilizzare nei casi in cui i risultati della determinazione da parte di altri metodi sembrano essere discutibile, e per determinare la perdita di proteine ​​giorno nei pazienti nefrologici.

Il metodo Lowry, che ha una sensibilità maggiore rispetto al metodo del biureto, combina la reazione del biureto e la reazione di Folin con gli aminoacidi tirosina e triptofano nella molecola proteica. Nonostante l'elevata sensibilità, questo metodo non sempre fornisce risultati affidabili nella determinazione del contenuto proteico nelle urine. La ragione di ciò è l'interazione non specifica del reagente di Folin con componenti non proteici dell'urina (spesso amminoacidi, acido urico, carboidrati). La separazione di questi e di altri componenti delle urine mediante dialisi o precipitazione proteica consente di utilizzare con successo questo metodo per la determinazione quantitativa delle proteine ​​delle urine. Alcuni farmaci - salicilati, clorpromazina, tetracicline sono in grado di influenzare questo metodo e distorcono i risultati dello studio.

La sufficiente sensibilità, la buona riproducibilità e la facilità di determinazione delle proteine ​​mediante coloranti leganti rendono questi metodi promettenti, ma l'alto costo dei reagenti impedisce un loro più ampio uso nei laboratori. Allo stato attuale, il metodo del pyrogallol red sta diventando più comune in Russia.

Nel condurre uno studio sul livello di proteinuria, si deve tenere presente che i diversi metodi per determinare la proteinuria hanno sensibilità e specificità diverse per numerose proteine ​​delle urine.

Sulla base dei dati empirici, si consiglia di determinare la proteina con due metodi diversi e calcolare il valore reale utilizzando una delle seguenti formule:

proteinuria = 0,4799 B + 0,5230 L;
proteinuria = 1,5484 B - 0,4825 S;
proteinuria = 0,2167 S + 0,7579 L;
proteinuria = 1,0748 P - 0,0986 B;
proteinuria = 1.0104 P - 0.0289 S;
proteinuria = 0,8959 P + 0,0845 L;

dove:
B - risultato della misurazione con Coomassie G-250;
L è il risultato della misurazione con il reagente di Lowry;
P - risultato della misurazione con pirogallolo molibdato;
S è il risultato della misurazione con acido solfosalicilico.

Considerando le fluttuazioni pronunciate del livello di proteinuria in diversi momenti della giornata, così come la dipendenza della concentrazione di proteine ​​urinarie sulla diuresi, il suo diverso contenuto nelle singole porzioni di urina, è ormai comune per la patologia renale valutare la gravità della proteinuria dalla perdita giornaliera di proteine ​​nelle urine, cioè determinare il cosiddetto proteinuria giornaliera. È espresso in g / giorno.

Se è impossibile raccogliere l'urina giornaliera, si raccomanda di determinare la concentrazione di proteine ​​e creatinina in una singola porzione di urina. Poiché il tasso di rilascio di creatinina durante il giorno è abbastanza costante e non dipende dai cambiamenti nella velocità della minzione, il rapporto tra concentrazione di proteine ​​e concentrazione di creatinina è costante. Questo rapporto si correla bene con l'escrezione giornaliera di proteine ​​e, pertanto, può essere utilizzato per valutare la gravità della proteinuria. Il rapporto proteina / creatinina normale dovrebbe essere inferiore a 0,2. Proteine ​​e creatinina sono misurate in g / l. Un importante vantaggio del metodo di valutazione della gravità della proteinuria per il rapporto tra proteina e creatinina è la completa eliminazione degli errori associati all'incapacità o alla raccolta incompleta dell'urina quotidiana.

riferimenti:

• O. V. Novoselova, M. B. Pyatigorskaya, Yu. E. Mikhailov, "Aspetti clinici del rilevamento e valutazione della proteinuria", Manuale del capo della CPL, n. 1, gennaio 2007
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• VI Pupkova, L.M. Prasolov - Determinazione delle proteine ​​nelle urine e nel liquido cerebrospinale. Koltsovo, 2007
• Manuale di metodi di ricerca clinica di laboratorio. Ed. E. A. Kost. Mosca, "Medicina", 1975

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Metodi per la determinazione delle proteine ​​nelle urine

Una piccola quantità di proteine ​​nell'urina quotidiana si trova anche in individui completamente sani, tuttavia tali piccole concentrazioni non vengono rilevate in singole porzioni usando metodi attualmente usati. Circa il 70% delle proteine ​​urinarie di una persona in buona salute rappresentano l'uromucoide, una proteina che è un prodotto del tessuto renale; quindi, la proporzione di proteina glomerulare nelle urine di persone sane è trascurabile e la proteinuria normalmente è 50-150 mg / die, con la maggior parte delle proteine ​​urine identiche al siero di latte.

È accettato distinguere le seguenti forme di proteinuria a seconda del luogo di origine: prerenale, associato a una maggiore ripartizione della proteina tissutale, grave emolisi; renale, a causa della patologia dei reni, che può essere suddivisa in glomerulare e tubulare; postrenale, associato alla patologia delle vie urinarie e più spesso causato da essudazione infiammatoria.

A seconda della durata dell'esistenza, emettono proteinuria persistente, che esiste per molte settimane e persino anni, e transitoria, che appare periodicamente, a volte anche in assenza di malattia renale, ad esempio, con febbre e grave intossicazione. È consigliabile distinguere tra la variabilità della proteinuria: con perdita giornaliera di proteine ​​fino a 1 g - moderata, da 1 a 3 g - media e più di 3 g - pronunciata.

La rilevazione nell'urina di proteine ​​con un peso molecolare relativamente grande indica l'assenza di selettività del filtro renale e il suo danno pronunciato. In questi casi, parliamo della bassa selettività della proteinuria. Pertanto, al momento, la definizione delle frazioni di proteine ​​urinarie è diventata diffusa. I metodi più accurati sono l'elettroforesi in gel di amido e poliacrilammide.
Secondo i risultati ottenuti con questi metodi, si può giudicare la selettività della proteinuria.

La maggior parte dei metodi qualitativi e quantitativi per determinare la proteina nelle urine si basano sulla sua coagulazione nel volume di urina o nell'interfaccia tra i media (urina e acido); se c'è un modo per misurare l'intensità della coagulazione, allora il campione diventa quantitativo.

Saggio acido solfosalicilico unificato:

Reagente richiesto:

Soluzione di acido solfosalicilico al 20%.

Il corso dello studio:

In 2 provette versare 3 ml di urina filtrata. Nella provetta aggiungere 6-8 gocce di reagente. Su uno sfondo scuro confrontare il tubo di controllo con un esperto. La torbidità nella provetta indica la presenza di proteine, il campione è considerato positivo.

Se la reazione dell'urina è alcalina, prima dell'esame si acidifica con 2-3 gocce di una soluzione acquosa al 10% di acido acetico.

Metodo unificato di Brandberg-Roberts-Stolnikov:

Il metodo si basa sul campione dell'anello di Geller, che consiste nel fatto che al confine tra acido nitrico e urina, in presenza di proteine, si verifica la coagulazione e appare un anello bianco.

Reagente richiesto:

Soluzione al 30% di acido nitrico (densità relativa 1,2) o reagente larionico.
Preparazione del reagente Larione: 20-30 g di cloruro di sodio vengono sciolti riscaldando in 100 ml di acqua distillata, lasciati raffreddare, filtrati. A 99 ml del filtrato viene versato 1 ml di acido nitrico concentrato.

Il corso dello studio:

1-2 ml di acido nitrico (o reagente di acido larionico) vengono versati nel tubo e con attenzione, sopra la parete del tubo, si sovrappone la stessa quantità di urina filtrata. L'aspetto di un sottile anello bianco all'interfaccia di due liquidi tra il 2 ° e il 3 ° minuto indica la presenza di proteine ​​ad una concentrazione di circa 0,033 g / l. Se l'anello appare prima di 2 minuti dopo la stratificazione, l'urina deve essere diluita con acqua e ridisegnare l'urina già diluita. Il grado di diluizione dell'urina è selezionato in base al tipo di anello, cioè la sua larghezza, compattezza e tempo di apparizione. Con un anello simile a un filo, che è apparso prima di 2 minuti, l'urina viene diluita 2 volte, con una larga - 4 volte, con una compatta - 8 volte, ecc. La concentrazione di proteine ​​viene calcolata moltiplicando 0,033 per il tasso di diluizione ed è espressa in grammi per 1 l (g / l).

A volte si ottiene un anello bianco quando sono presenti grandi quantità di urati. In contrasto con l'anello proteico, l'urato è leggermente più alto del confine tra due liquidi e si scioglie quando è leggermente riscaldato.

Determinazione quantitativa della proteina nelle urine mediante torbidità, formata dall'aggiunta di acido solfosalicilico:

Il principio del metodo:

L'intensità della torbidità durante la coagulazione delle proteine ​​con acido sulfosalicilico è proporzionale alla sua concentrazione.

Reagenti richiesti:

1. Soluzione di acido solfosalicilico al 3%.

2. soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%.

3. Soluzione di albumina standard - soluzione all'1% (1 ml di soluzione contenente 10 mg di albumina): 1 g di albumina liofilizzata (da siero umano o bovino) viene sciolta in una piccola quantità di soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% in un matraccio con una capacità di 100 ml e quindi adattato al marchio con la stessa soluzione. Il reagente viene stabilizzato aggiungendo 1 ml di soluzione di sodio azide al 5% (NaN3). Se conservato in frigorifero, il reagente ha una validità di 2 mesi.

Attrezzatura speciale - colorimetro fotoelettrico.

Il corso dello studio:

1,25 ml di urina filtrata vengono introdotti in una provetta, portata a 5 ml con una soluzione di acido solfosalicilico al 3% e miscelati. Dopo 5 minuti, vengono misurati su un colorimetro fotoelettrico a una lunghezza d'onda di 590-650 nm (filtro a luce arancione o rossa) contro un controllo in una cella con una lunghezza del percorso ottico di 5 mm. Il controllo è un tubo in cui sono stati aggiunti 1,25 ml di urina filtrata fino a 5 ml di soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%. Il calcolo viene eseguito secondo il programma di calibrazione, per la costruzione di quali diluizioni vengono preparate dalla soluzione standard, come indicato nella tabella.

Da ciascuna soluzione risultante, vengono prelevati 1,25 ml e trattati come campioni sperimentali.

La dipendenza rettilinea quando si costruisce un grafico di calibrazione è memorizzata fino a 1 g / l. A concentrazioni più elevate, il campione deve essere diluito e tenere conto della diluizione nel calcolo.

Risultati falsi positivi possono essere ottenuti se ci sono agenti di contrasto nelle urine contenenti iodio organico. Pertanto, il test non può essere utilizzato in soggetti che assumono preparazioni di iodio; un risultato falso positivo può anche essere dovuto a preparazioni di sulfanilamide, grandi dosi di penicillina e ad alte concentrazioni nelle urine di acido urico.

Metodo Biuret:

Il principio del metodo:

I legami peptidici della proteina con sali di rame in forma alcalina C formano un complesso di colore viola. Le proteine ​​sono pre-precipitate con acido tricloroacetico.

Reagenti richiesti:

1. Soluzione al 10% di acido tricloroacetico.
2. Soluzione di rame al 20% (CuSO4 ∙ 5H2O).
3. Soluzione di NaOH al 3%.

Il corso dello studio:

A 5 ml di urina prelevata dalla quantità giornaliera, aggiungere 3 ml di soluzione di acido tricloroacetico, centrifugati ad un volume costante di sedimento. Il surnatante viene aspirato con una pipetta, il precipitato viene quindi disciolto in 5 mi di soluzione di NaOH. 0,25 ml di CuSO4 vengono aggiunti alla soluzione, la miscela viene agitata e centrifugata. Il supernatante viene fotometrizzato alla lunghezza d'onda di 540 nm in una cuvetta con una lunghezza del percorso ottico di 10 mm contro acqua distillata. La concentrazione della proteina viene calcolata dalla curva di calibrazione, mentre la si traccia, la concentrazione della proteina (g / l) viene tracciata sull'asse ye la densità ottica nelle unità di estinzione sull'asse delle ascisse. In base alla concentrazione ottenuta, viene calcolata la perdita giornaliera di proteine ​​nelle urine.

Usando la carta indicatore (strisce):

Le proteine ​​possono essere rilevate usando carta indicatore (strisce), prodotte da "Albuphan", "Ames" (Inghilterra), "Albustix", "Boehringer" (Germania), "Comburtest", ecc.

Il principio si basa sul fenomeno del cosiddetto errore proteico di alcuni indicatori acido-base. La parte dell'indicatore della carta è satura di tampone di tetrabromofenolo blu e citrato. Quando la carta è inumidita, il tampone si scioglie e fornisce il pH appropriato per la reazione dell'indicatore.

A 3,0-3,5 gruppi amminici di proteine ​​reagiscono con l'indicatore e cambiano il suo colore giallo originale in un blu verdastro, dopo di che, confrontato con la scala cromatica, è possibile stimare approssimativamente la concentrazione proteica nelle urine. Il prerequisito principale per il corretto funzionamento delle strisce indicatrici è di fornire un pH nell'intervallo di 3,0-3,5 affinché la reazione si verifichi.

Se la carta è in contatto con l'urina in studio più a lungo dell'esposizione specificata nelle istruzioni, il tampone citrato si dissolve in esso, e quindi l'indicatore reagisce al pH reale dell'urina, vale a dire dà una reazione falsa positiva. A causa del fatto che la capacità del tampone è limitata, anche se le linee guida sono seguite in campioni di urina troppo alcalina (pH> 6,5), si ottengono risultati falsi positivi e in campioni di urina troppo acida (pH 6,5), con una bassa densità relativa urina e a bassa concentrazione di proteine ​​bens jones.

Reagenti richiesti:

Tampone acetato 2 M pH 4.9.

Il corso dello studio:

L'urina filtrata nella quantità di 4 ml viene miscelata con 1 ml di tampone e riscaldata per 15 minuti a bagnomaria ad una temperatura di 56 ° C. In presenza di proteine ​​Bens-Jones, un precipitato pronunciato appare entro 2 minuti e, se la concentrazione di proteine ​​di Bens-Jones è inferiore a 3 g / l, il campione può essere negativo. In pratica, questo è estremamente raro, poiché per la maggior parte la concentrazione della proteina Bens-Jones nelle urine è significativa.

Con assoluta certezza, la proteina Bens-Jones può essere rilevata da uno studio immunoelettroforetico utilizzando sieri specifici contro le catene pesanti e leggere delle immunoglobuline.

Determinazione dell'albumosi (proteosi):

Le albume sono prodotti dalla scissione proteica, il cui principio si basa sul fatto che non si piegano quando sono bolliti, ma danno una reazione biuretica positiva e vengono salati con alcuni sali, in particolare il solfato di ammonio e lo zinco acetato in un mezzo acido.

L'urina normale non contiene l'albumosi. Le tracce possono essere in urina normale in caso di impurità di sperma. In patologia, l'albumosi può verificarsi nelle urine durante condizioni febbrili, trasfusioni di sangue e plasma, riassorbimento di essudati e trasudati e disintegrazione dei tumori.

Reagenti richiesti:

1. Soluzione satura di cloruro di sodio.
2. Soluzione concentrata di soda caustica.
3. Una soluzione debole di solfato di rame (quasi incolore).

Il corso dello studio:

Una soluzione satura di cloruro di sodio (1/3 di volume) viene aggiunta all'urina acidificata con acido acetico, bollita e il liquido caldo viene filtrato. Le albume passano nel filtrato, in cui la loro presenza è determinata da una reazione del biureto. Al filtrato aggiungere 1/2 volume di una soluzione concentrata di soda caustica e alcune gocce di una soluzione debole di solfato di rame. Con un campione positivo, si ottiene un colore rosso-viola.

Con un test positivo con acido sulfosalicilico, l'urina viene riscaldata. Se la torbidità scompare e riappare quando viene raffreddata, significa che l'urina contiene albumosi o il corpo proteico di Bens-Jones.

Proteine ​​nelle urine, test di laboratorio

Metodi per la determinazione delle proteine ​​delle urine

Per la clinica importa sia la determinazione qualitativa che quantitativa delle proteine ​​nelle urine.

Test qualitativi per la determinazione delle proteine ​​urinarie
Proposto più di 100 reazioni per la determinazione qualitativa delle proteine ​​nelle urine. La maggior parte di essi si basa sulla precipitazione proteica mediante mezzi fisici (riscaldamento) o chimici. La presenza di proteine ​​è dimostrata dalla comparsa di torbidità.

Interessanti anche i campioni colorimetrici a secco.

Di seguito verrà descritto solo il più importante per la pratica del campione.

Saggio dell'acido solfosalicilico. A pochi millilitri di urina aggiungere 2-4 gocce di una soluzione al 20% di acido solfosalicilico. Quando una reazione positiva appare torbidità. Il risultato è denotato dai termini: opalescenza, una reazione debolmente positiva, positiva o fortemente positiva. Il test dell'acido solfosalicilico è uno dei campioni più sensibili per la determinazione delle proteine ​​nelle urine. Trova anche i più piccoli aumenti anormali delle proteine ​​delle urine. Grazie ad una tecnica semplice, questo test ha trovato ampia applicazione.

Test con aseptolo. Aseptolo è un sostituto dell'acido solfosalicilico. Può essere preparato con materiali disponibili in qualsiasi laboratorio (fenolo e acido solforico). Come reagente, viene utilizzata una soluzione di aseptolo al 20%. Il test viene eseguito come segue: in una provetta contenente 2-3 ml di urina, aggiungere 0,5-1-1 ml di soluzione di aseptolo sul fondo. Se un anello bianco di proteina coagulata risulta al confine tra due liquidi, il campione è positivo.

Il test di Geller. Sotto pochi millilitri di urina, 1-2 ml di acido nitrico al 30% (peso specifico di gravità 1,20) viene salato. Se viene prodotto un anello bianco all'interfaccia di entrambi i liquidi, il campione è positivo. La reazione diventa positiva se la proteina è superiore al 3,3 mg%. A volte si ottiene un anello bianco quando sono presenti grandi quantità di urati. In contrasto con l'anello proteico, l'anello urato non appare al confine tra i due liquidi, ma leggermente più alto. Larionova propone di utilizzare al posto del 30% di acido nitrico come soluzione di reagente all'1% di acido nitrico in una soluzione satura di cloruro di sodio; Ciò fornisce grandi risparmi nell'acido nitrico.

Campione con zhelezystosinerodisty potassio e acido acetico. Questa reazione consente di isolare le proteine ​​sieriche da albumina di calcio.

Quantità uguali di urina vengono versate in due provette. In uno di essi aggiungere alcune gocce di soluzione al 30% di acido acetico. Se si ottiene torbidità rispetto alla provetta di controllo, l'urina contiene la creatina di albumina. Se non appare torbidità, il contenuto di entrambe le provette viene mescolato e nuovamente diviso in due parti. In una delle due provette, aggiungere alcune gocce (un eccesso può trasformare un campione positivo in uno negativo) di una soluzione al 10% del sale giallo sangue (sciroppo di ferrocianuro di potassio). In presenza di proteine ​​del siero, si ottiene torbidità.

Con un'urina concentrata contenente grandi quantità di acido urico e urato, un campione con acido ferrico e sciroppo di potassio e acido acetico deve essere eseguito dopo diluizione preliminare (2-3 volte) di urina con acqua. Altrimenti, può verificarsi torbidità causata da acido urico precipitato.

Ciò è particolarmente importante nello studio dell'urina nei bambini, che contiene molto acido urico e urati.

Del resto dei campioni qualitativi di proteine ​​nelle urine, basati sulla precipitazione proteica, hanno trovato applicazione: test di ebollizione, Esbach, Perdi, Roberts, Almen, Balloni, Buro, Claudio, Corso, Cupola, Goodmann-Suzanne, Jolla, Exton, Kamlet, Kobuladze, Liliendal-Petersen, Polacci, Pons, Spiegler, Tanre, Thiele, Brown, Tsushia, ecc.

Nella produzione di campioni di alta qualità per le proteine ​​nelle urine, sulla base della deposizione di proteine, è necessario osservare le seguenti regole generali, la cui violazione porta a errori significativi nello studio.

1. L'urina da testare deve essere acida. Con una reazione alcalina, l'urina viene leggermente acidificata con acido acetico. La produzione di un campione con urina alcalina nei casi in cui un acido viene utilizzato come reagente può portare alla neutralizzazione dell'acido e ad un risultato negativo con una reazione positiva. Ciò è particolarmente vero per il test dell'acido solfosalicilico, poiché l'acido viene aggiunto in piccolissime quantità e può essere facilmente neutralizzato.

2. L'urina investigata dovrebbe essere trasparente.

3. I campioni per stabilire la proteina nelle urine dovrebbero sempre essere fatti in due tubi, uno dei quali serve come controllo. Senza un tubo di controllo, non si può notare torbidità della luce durante le reazioni.

4. La quantità di acido aggiunto nei campioni non deve essere troppo grande. Una grande quantità di acido può portare alla formazione di acido solubile in albumina e alla trasformazione di un campione positivo in uno negativo.

A causa della loro tecnica semplice, i campioni colorimetrici a secco meritano molta attenzione. Quando vengono utilizzati questi campioni, l'effetto che la proteina ha sul colore dell'indicatore nella soluzione tampone (i cosiddetti indicatori di errore proteico). Una carta filtrante infusa con tampone di acido citrico e blu di bromofenolo come indicatore viene assorbita nell'urina per un breve periodo. Il campione è positivo se diventa di colore blu-verde. Confrontando l'intensità della colorazione con gli standard di carta colorata, è possibile derivare conclusioni approssimative e quantitative. La carta dell'indicatore è venduta in pacchi con gli standard di colore corrispondenti, come la carta indicatore universale.

Metodi per la determinazione quantitativa delle proteine ​​delle urine
Molti metodi sono stati proposti per la determinazione quantitativa delle proteine ​​delle urine. Metodi quantitativi esatti per la determinazione delle proteine ​​in materiale biologico non sono ampiamente utilizzati nella determinazione delle proteine ​​nelle urine, a causa di tecniche complesse e che richiedono tempo. I metodi volumetrici sono diffusi, in particolare il metodo Esbach. Sono molto semplici, ma sfortunatamente non sono molto accurati. I metodi del gruppo Brandberg-Stolnikov, che danno risultati più accurati rispetto ai metodi volumetrici, con una tecnica relativamente semplice, sono anche convenienti per la clinica. In presenza di un fotometro o nefelometro, i metodi nefelometrici sono anche convenienti.

Metodo Esbach. Fu proposto dal medico parigino Esbach nel 1874. Versare l'urina e il reagente in una provetta speciale (l'albuminometro di Esbach). Il tubo è sigillato con un tappo di gomma, mescolato con cura (senza battere!) E lasciato in posizione verticale fino al giorno successivo. Segnala la divisione, che raggiunge la colonna di precipitato proteico. Il numero trovato mostra il contenuto di proteine. È molto importante con il metodo Esbach che l'urina sia acida. L'urina alcalina può neutralizzare i costituenti acidi del reagente e prevenire la precipitazione delle proteine.

Vantaggi del metodo: è semplice e conveniente nella pratica.

Svantaggi: il metodo è impreciso, il risultato è ottenuto dopo 24 - 48 ore.

Metodo Brandberg-Stolnikov. È basato sul test di qualità di Geller. Il campione di Geller può essere utilizzato per la determinazione quantitativa, poiché fornisce un risultato positivo con un contenuto di proteine ​​superiore al 3,3 mg%. Questa è l'ultima concentrazione di proteine ​​al di sotto della quale il campione diventa negativo.

Modifica di Ehrlich e Althausen. Gli scienziati sovietici S. L. Ehrlich e A. Ya. Altgauzen hanno modificato il metodo Brandberg-Stolnikov, indicando le possibilità di semplificare la ricerca e di risparmiare tempo nella sua produzione.

La prima semplificazione è associata al tempo di apparizione dell'anello. È determinato esattamente il tempo del suo aspetto, senza necessariamente aderire al 2 ° e 3 ° minuto.

La seconda semplificazione consente di stabilire quale tipo di allevamento dovrebbe essere fatto. Gli autori hanno dimostrato che la diluizione richiesta può essere approssimativamente stabilita dal tipo di anello ottenuto. Distinguono filamentoso, ampio
e anello compatto.

Dei metodi nefelometrici, il metodo Kingsberry e Clark merita di essere notato. 2,5 ml di urina filtrata vengono versati in un cilindro graduato piccolo, reintegrato con una soluzione acquosa al 3% di acido solfosalicilico a 10 ml. Mescolare accuratamente e, dopo 5 minuti, fotometro in una cuvetta da 1 cm, con un filtro giallo, usando acqua come liquido di compensazione. Con il fotometro Pulfrich, l'estinzione trovata, moltiplicata per 2,5, dà la quantità di proteine ​​in% o. Nel caso in cui l'indice di estinzione sia superiore a 1,0, l'urina viene pre-diluita 2 volte, 4 volte o anche più.

Per avere una chiara idea della quantità di proteine ​​escrete nelle urine, è necessario determinare non solo la loro concentrazione in una porzione separata di urina, ma anche la loro quantità giornaliera totale. Per fare ciò, raccogliere l'urina del paziente per 24 ore, misurarne il volume in millilitri e determinare la concentrazione di proteine ​​in una porzione di urina giornaliera in g%. La quantità di proteine ​​escrete nelle urine in 24 ore è determinata in base alla quantità giornaliera di urina in grammi.

Il significato clinico delle proteine ​​nelle urine

L'urina umana contiene normalmente quantità minime di proteine ​​che non possono essere stabilite con campioni di test qualitativi di urina qualitativa. Escrezione di grandi quantità di proteine, in cui i normali campioni di alta qualità per le proteine ​​nelle urine diventano positivi - un fenomeno anormale, chiamato proteinuria. La proteinuria è fisiologica solo nel neonato, nei primi 4-10 giorni dopo la nascita. Il nome albuminuria, comunemente usato, è sbagliato, perché non solo l'albumina, ma anche altri tipi di proteine ​​(globuline, ecc.) Vengono escreti nelle urine.

La proteinuria, come sintomo diagnostico, fu scoperta nel 1770 da Cotuno.

La più importante proteinuria renale funzionale nei bambini è la seguente:

1. Proteuria fisiologica del neonato. Si verifica nella maggior parte dei neonati e non ha alcun significato avverso. È spiegato da un filtro renale immaturo, danno alla nascita o perdita di liquidi nei primi giorni di vita. La proteinuria fisiologica scompare il 4-10 ° giorno dopo la nascita (in bambini prematuri più tardi). La quantità di proteine ​​è piccola. È un albumalbumico.

L'albuminuria neonatale, che dura a lungo, può essere un sintomo dei lombi congeniti.

2. albuminuria da ictus. Sono causati dal superamento della soglia di normale irritabilità del filtro renale da significative irritazioni meccaniche, termiche, chimiche, mentali e di altro tipo - perdita di liquidi nei neonati (proteinuria di disidratazione), bagni freddi, cibo ricco di proteine ​​(proteinuria alimentare), palpazione del rene (albuminuria palpatoria), sovraccarico fisico, paura, ecc.

L'albuminuria da ictus appare più facilmente nei bambini in tenera età rispetto ai bambini in età avanzata e negli adulti, poiché i reni di un neonato e di un bambino piccolo sono più facilmente irritati. L'albuminuria da disidratazione (disturbi dell'alimentazione, idrolabilità, tossicosi, diarrea, vomito) è particolarmente comune nei bambini.

L'albuminuria da ictus è benigna. Scompaiono immediatamente dopo l'eliminazione delle loro cause. I leucociti occasionali, i cilindri e i globuli rossi si trovano talvolta nel sedimento. La proteina è più spesso un albumalbumina.

3. proteinuria ortostatica. Questa condizione è caratteristica dei bambini in età prescolare e in età scolare. Si verifica sulla base di disturbi vasomotori nel rifornimento di sangue al rene. Tipico per l'albuminuria ortostatica (da cui il suo nome) è che appare solo quando il bambino è in piedi, quando la colonna vertebrale si trova in una posizione lordotica. Nella posizione supina, scompare. Viene rilasciato il genealbumina. Nei casi dubbi, è possibile ricorrere all'esperienza ortostatica, che consiste nel seguente: alla sera, un'ora prima di coricarsi, il bambino svuota la vescica; la mattina, alzandosi dal letto, rilascia di nuovo l'urina. Questa urina non contiene proteine. Quindi il bambino viene messo in ginocchio per 15-30 minuti con un bastone dietro la schiena, tra i gomiti di entrambe le mani piegate. Crea una posizione di lordosi, che porta al rilascio di proteine, senza cambiamenti nei sedimenti.

Con albuminuria ortostatica, possono essere rilasciati 8-10 g di proteine ​​al giorno.

La proteinuria renale organica è di grande importanza clinica tra tutta la proteinuria. Sono causati da malattie renali organiche (nefrite, nefrosi, nefrosclerosi). La proteinuria è uno dei sintomi più importanti e più noti della malattia renale organica.

1. Nella glomerulonefrite acuta e cronica, la proteinuria si presenta regolarmente. La quantità di proteine ​​è moderata e non esiste un parallelo tra il grado di proteinuria e la gravità della malattia. Al contrario, la giada cronica e più grave si presenta spesso con quantità minori di proteine ​​rispetto a quelle acute. Dopo nefrite acuta, a volte per un lungo periodo (anni), si stabiliscono piccole quantità di proteine ​​nelle urine, senza alcun significato patologico ("albuminuria residua"). Non si deve dimenticare che può verificarsi anche "nefrite senza proteinuria". A volte le proteine ​​si trovano in una porzione di urina e in un'altra no. Il rapporto tra albumina e globuline nella nefrite acuta è basso e nella nefrite cronica è maggiore.

2. In caso di nefrosclerosi, la quantità di proteine ​​nelle urine è insignificante, spesso si riscontrano le forme della malattia prive di proteine ​​nelle urine.

3. Di tutte le malattie renali, la nefrosi si verifica con la proteinuria più pronunciata.

4. In caso di condizioni infettive e tossiche, si trovano la cosiddetta proteinuria febbrile e tossica. Questi sono nefrosi acuta, in cui la quantità di proteine ​​è piccola. Questo gruppo comprende anche proteinuria in stati convulsivi (convulsioni), ipertiroidismo, ittero, invaginazioni, enterocolite, ustioni, anemia grave, ecc. Questi albuminuria sono benigni e passano rapidamente (albuminuria transitoria).

5. Quando il sangue ristagna nei reni, si verifica la cosiddetta albuminuria congestizia, che è caratteristica dei pazienti cardiovascolari nella fase di scompenso. Si trova anche nelle ascite e nei tumori dell'addome.

In albuminuria febbrile, tossica e congestizia, l'aumentata permeabilità del filtro renale è particolarmente pronunciata. Secondo alcuni autori, molti di questi proteinuria si verificano senza danno organico al parenchima renale.

L'albuminuria extrarenale è solitamente causata da impurità proteiche (secrezioni, cellule scomposte) che sono secrete dal tratto urinario malato e dagli organi sessuali. L'albuminuria extrarenale è spesso riscontrata a causa di cistopielite (piuria), meno frequente a causa di vulvovaginiti, calcoli e tumori del tratto urinario.

Quando l'albuminuria extrarenale nel sedimento trova un gran numero di leucociti e batteri. Gli elementi renali non si verificano quasi mai. La quantità di proteine ​​è piccola. L'urina filtrata o centrifugata di solito non fornisce un campione proteico positivo.

Nelle persone che guariscono dalla pielite, l'albuminuria scompare dopo batteriuria e piuria.

Va sottolineato come un fenomeno caratteristico che nella prima infanzia le malattie renali organiche sono estremamente rare, quindi anche la proteinuria organica è rara. Di loro si trovano, principalmente, febbrili e tossici. A differenza della proteinuria organica, l'albuminuria da ictus è molto comune nei bambini piccoli.

Nei bambini più grandi, la proteinuria organica è più spesso funzionale. In generale, con l'età, la proteinuria funzionale è meno comune e più organica.

Studi elettroforetici di proteine ​​nelle urine

Un certo numero di autori usa il metodo elettroforetico per lo studio delle proteine ​​nelle urine (uroproteine). Dall'elettroforegramma ottenuto è chiaro che hanno la stessa composizione qualitativa delle proteine ​​plasmatiche. Questo indica che le proteine ​​nelle urine provengono da proteine ​​del plasma.

Determinazione qualitativa e quantitativa delle proteine ​​nelle urine.

Valori normali: la normale proteina nelle urine è contenuta in quantità minime che non vengono rilevate dalle consuete reazioni qualitative. Il limite superiore della norma di proteine ​​nelle urine è 0,033 g / l. Se il contenuto di proteine ​​è superiore a questo valore, i campioni di proteine ​​di alta qualità diventano positivi.

Il significato clinico della definizione:

L'aspetto delle proteine ​​nelle urine è chiamato proteinuria. La proteinuria può essere falsa e renale. La proteinuria extrarenale può essere in presenza di impurità di origine proteica dagli organi genitali (vaginite, uretrite, ecc.), Mentre la quantità di proteine ​​è insignificante - fino a 0,01 g / l. La proteinuria renale può essere funzionale (con ipotermia, sforzo fisico, febbre) e organica - con glomerulonefrite, pielonefrite, nefrite, nefrosi, insufficienza renale. Nella proteinuria renale, il contenuto proteico può variare da 0,033 a 10-15 g / l, a volte più alto.

Il principio del metodo: si basa sul fatto che la proteina sotto l'azione degli acidi inorganici si coagula (diventa visibile). Il grado di torbidità dipende dalla quantità di proteine.

Rilevazione di proteine ​​nelle urine con acido solfosalicilico al 20%.

Reagenti: soluzione al 20% di acido solfosalicilico. Attrezzatura: sfondo scuro.

1. Requisiti per l'urina: l'urina deve essere acida (o leggermente acida) pH, deve essere trasparente, per questo scopo, l'urina viene centrifugata. L'urina alcalina viene acidificata in un mezzo di reazione debolmente acido, usando la carta dell'indicatore per il controllo.

2. In 2 provette dello stesso diametro versare 2 ml di urina preparata. 1 provetta - controllo, 2 - esperienza. Alla provetta aggiungere 4 gocce di acido solfosalicilico al 20%.

3. Il risultato è segnato su uno sfondo scuro.

4. In presenza di proteine, l'urina nella provetta diventa torbida.

Determinazione di alta qualità delle proteine ​​nelle urine mediante strisce reattive.

Per identificare la proteinuria, vengono utilizzate varie strisce monotest: Albufan, Albustiks, Biofan E e test politici: Triscan, Nonafan e altri.

Rilevazione di proteine ​​nelle urine con il metodo di Roberts - Stolnikov.

Il principio del metodo: si basa sul fatto che la proteina sotto l'azione degli acidi inorganici si coagula (diventa visibile). Il grado di torbidità dipende dalla quantità di proteine ​​(cioè il test dell'anello di Geller). Quando la concentrazione di proteine ​​nelle urine è di 0,033 g / l, entro la fine di 3 minuti dopo la stratificazione delle urine appare un sottile filo bianco.

Reagenti: soluzione al 50% di acido nitrico o reagente di Roberts (98 parti di una soluzione satura di cloruro di sodio e 2 parti di acido cloridrico concentrato) o reagente di Larionic (98 parti di una soluzione satura di cloruro di sodio e 2 parti di acido nitrico concentrato).

Attrezzatura: sfondo scuro.

1. Requisiti per l'urina: l'urina deve essere acida (o leggermente acida) pH, deve essere trasparente, per questo scopo, l'urina viene centrifugata. L'urina alcalina viene acidificata in un mezzo di reazione debolmente acido, usando la carta dell'indicatore per il controllo.

2. Versare 2 ml di soluzione al 50% di acido nitrico o uno dei reagenti in una provetta, quindi versare con attenzione lo stesso volume di urina preparata lungo la parete del tubo con una pipetta.

3. Il campione viene lasciato per 3 minuti

4. Dopo 3 minuti, segnala il risultato. Il risultato è segnato su uno sfondo scuro in luce trasmessa. Se l'anello è largo, compatto, l'urina viene diluita con acqua distillata e nuovamente stratificata sul reagente.

5. L'urina viene diluita fino a quando dopo 3 minuti si forma un sottile anello filamentoso.

6. Il calcolo del contenuto proteico nelle urine viene prodotto secondo la formula:

C = 0,033 g / l x grado di diluizione.

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Sviluppo metodico delle classi pratiche "Determinazione delle proteine ​​nelle urine" (1 corso)

Capital Training Center
Mosca

Argomento: determinazione della proteina urinaria.

Obiettivo: studiare lo studio delle proprietà chimiche dell'urina.

Studiare i metodi quantitativi e qualitativi per determinare la proteina urinaria;

Impara i principi di base del lavoro con le strisce reattive sugli analizzatori automatici.

Tipo di impiego: pratico (6 ore)

Lo studente dovrebbe sapere:

Campioni qualitativi per la determinazione delle proteine.

Roberts - Metodo di Stolnikov.

Determinazione della proteina 3% SSC.

Metodo della determinazione proteica del biureto (THU).

Il valore diagnostico degli indicatori di ricerca.

Lo studente dovrebbe essere in grado di:

Preparare un luogo di lavoro per il test delle urine.

Preparare reagenti, piatti e attrezzature per lo studio.

Determinare le proprietà chimiche dell'urina (proteine ​​nelle urine mediante metodi qualitativi e quantitativi).

Lavorare con prodotti in bianco (progettazione di moduli di analisi).

Interpretare correttamente i risultati dello studio.

Mezzi per raggiungere l'obiettivo:

1. Lavora con note, letteratura educativa e speciale.

2. Preparazione per esercitazioni pratiche utilizzando le raccomandazioni metodologiche dell'insegnante, l'implementazione e l'esecuzione di lavori pratici.

3. Lavorare con mezzi di informazione informatici nei mezzi elettronici e cartacei.

Attrezzature per sala studio e postazioni di lavoro:

posti per numero di studenti;

posto di lavoro dell'insegnante;

mobili e attrezzature specializzate.

Strumenti di formazione tecnica:

computer per attrezzare il posto di lavoro dell'insegnante e degli studenti;

dispositivi tecnici per la visualizzazione audiovisiva di informazioni;

sussidi didattici audiovisivi (presentazione, video di formazione).

Il risultato della padronanza della lezione è:

Formazione di abilità professionali pratiche e esperienza pratica iniziale, comprese le competenze professionali (PC) e generali (QA):

PC 1.1. Preparare un posto di lavoro per le prove cliniche di laboratorio.

PC 1.2. Effettuare studi clinici di laboratorio su materiali biologici.

PC 1.3. Registra i risultati della ricerca.

PC 1.4. Smaltire il materiale usato, disinfettare e sterilizzare vetreria da laboratorio, strumenti e dispositivi di protezione usati.

OK 1. Capire la natura e il significato sociale della loro futura professione, mostrare un costante interesse in essa.

OK 2. Organizza le tue attività, scegli metodi standard e modi per svolgere compiti professionali, valuta la loro efficacia e qualità.

OK 6. Lavorare in team e team, comunicare in modo efficace con colleghi, dirigenti, pazienti.

OK 9. Essere guidati nelle condizioni del cambiamento tecnologico nell'attività professionale.

OK 13. Organizzare un luogo di lavoro in conformità con i requisiti di protezione del lavoro, igiene industriale, sicurezza infettiva e antincendio.

I modulo. La parte teorica con gli elementi del lavoro indipendente

Task numero 1. Studiare e delineare il materiale di studio nelle cartelle di lavoro.

Una persona sana di solito contiene meno di 0,002 g / l e raramente fino a 0,012 g / l di proteine, e di solito questo contenuto di proteine ​​urine è chiamato "sotto forma di tracce" e non viene rilevato dai metodi chimici convenzionali in urina umana sana.

Il contenuto proteico in porzioni di urina raccolte in diversi momenti della giornata può variare considerevolmente.

La proteina nelle urine si chiama proteinuria.

A seconda della perdita giornaliera di proteine, si distinguono i seguenti gradi di proteinuria: moderata - fino a 1 g; medio - da 1 a 3 g; pronunciato - più di 3 g.

Esistono due tipi principali di proteinuria:

Proteinuria, causata da malattie del tratto urinario;

proteinuria, con lesioni (malattie) dei reni.

Proteinuria associata a processi infiammatori delle vie urinarie, accompagnata dalla comparsa nelle urine di un numero significativo di leucociti o eritrociti, che, tuttavia, non elimina l'ingresso simultaneo di proteine ​​nelle urine dal parenchima renale; il contenuto proteico raramente supera 1 g / l.

La proteinuria renale nella maggior parte dei casi è associata ad una maggiore permeabilità dei glomeruli ed è divisa in 2 gruppi:

Alla proteinuria fisiologica sono inclusi i casi di comparsa temporanea di proteine ​​nelle urine, non associate a malattie:

dopo aver mangiato una grande quantità di cibo ricco di proteine ​​non denaturate (carne cruda, uova crude);

con un intenso lavoro muscolare (lunghe camminate, eventi sportivi);

quando fai un bagno o una doccia fredda;

con forti esperienze emotive;

con crisi epilettiche.

Distinguere la proteinuria ortostatica, o giovanile, che si manifesta nei bambini e negli adolescenti e con il passare degli anni. Nella relazione differenziale-diagnostica, è di importanza pratica che l'albuminuria ortostatica si trova spesso nel periodo di recupero dalla glomerulonefrite acuta.

La proteinuria renale patologica può essere il risultato di malattie organiche dei reni e di altri organi e sistemi: glomerulonefrite acuta; glomerulonefrite cronica; pielonefrite acuta; pielonefrite cronica; nefropatia delle donne incinte; varie malattie associate alla febbre; insufficienza cardiaca cronica grave; e malattia renale lieve; nefrosi lipoide; tubercolosi renale; febbri emorragiche; vasculite emorragica; anemia grave; ipertensione, ecc.

Task numero 2. Riscrivere e disegnare diagrammi di metodi di laboratorio per determinare la proteina nelle urine.

Metodi di laboratorio per la determinazione delle proteine ​​nelle urine

Esistono metodi qualitativi e quantitativi per la determinazione delle proteine ​​nelle urine, si basano sulla coagulazione delle proteine ​​nel volume delle urine o sul bordo dei media (urina e acido); mentre la misurazione del grado di coagulazione rende il campione quantitativo.

campione con acido solfosalicilico al 20% (standardizzato);

Geller ring test (attualmente non utilizzato);

rilevamento delle proteine ​​mediante l'uso di fogli indicatori (strisce) e strisce reattive.

il metodo unificato Brandberg-Roberts-Stolnikov;

con acido solfosalicilico al 3%.

Metodi qualitativi per la determinazione delle proteine ​​nelle urine

Task numero 3. Determinazione della proteina nelle urine utilizzando un campione standardizzato con acido solfosalicilico al 20%

Il principio del metodo: si basa sulla coagulazione delle proteine ​​nel volume di urina o sul bordo dei media (urina e acido)

Piatti, attrezzature e reagenti:

Acido solfosalicilico al 20% (acido 2-idrossi-5-solfobenzoico C ₇ H ₅ 0 ₆ S).

Urina filtrata 3 ml

2 pezzi provette chimiche

Tre tubi di urina filtrata vengono introdotti in due tubi, a uno di essi vengono aggiunti 6-8 gocce di acido sulfosalicilico (esperto). Su uno sfondo scuro vengono confrontati entrambi i tubi.

Interpretazione dei risultati:

Opacizzazione nella provetta indica la presenza di proteine ​​nelle urine - il campione è positivo.

Nota. L'urina alcalina viene acidificata prima del test aggiungendo alcune gocce di soluzione di acido acetico al 10%.

Task numero 4. Determinazione della proteina mediante il test dell'anello di Geller

Il principio del metodo: il campione dell'anello si basa sul fatto che quando l'acido nitrico viene aggiunto alle urine all'interfaccia (acido - urina) in presenza di proteine, si coagula e appare un anello bianco.

Piatti, attrezzature e reagenti:

- reagenti: soluzione al 30% di acido nitrico (HNO 3) (d = 1,2) o Laryonic Reactant: 20-30 g di cloruro di sodio (NaCl) sciolto in 100 ml di acqua distillata quando riscaldato, raffreddato, filtrato; 1 ml di HNO 3 concentrato viene aggiunto a 99 ml del filtrato.

Versare nella provetta 1 - 2 ml di una soluzione al 30% di HNO 3 o del reagente di Larionova e applicare delicatamente la stessa quantità di urina filtrata sulla parete.

Interpretazione dei risultati:

L'aspetto al confine di due liquidi tra il 2 ° e il 3 ° minuto di un sottile anello bianco indica la presenza di proteine ​​nelle urine.

Disegna uno schema per determinare la proteina

Quantificazione delle proteine

Il principio del metodo: il campione dell'anello di Geller si basa sul fatto che quando l'acido nitrico viene aggiunto alle urine all'interfaccia (acido - urina) in presenza di proteine, si coagula e appare un anello bianco.

Piatti, attrezzature e reagenti:

Fluido biologico (urina);

Versare nella provetta 1 - 2 ml di una soluzione al 30% di HNO 3 o del reagente di Larionova e applicare delicatamente la stessa quantità di urina filtrata sulla parete.

Interpretazione dei risultati:

L'aspetto al confine di due liquidi tra il 2 ° e il 3 ° minuto
un sottile anello bianco indica la presenza di proteine ​​ad una concentrazione di circa 0,033 g / l. Se un anello appare prima di 2 minuti dopo la laminazione, l'urina deve essere diluita con acqua distillata e ripetere il test con urina diluita. Il grado di diluizione dell'urina viene selezionato in base al tipo di anello, alla sua larghezza, alla sua compattezza e al tempo di apparizione.

Con un anello simile a un filo, che è apparso prima di 2 minuti, l'urina viene diluita 2 volte, con una larga - 4 volte, con una compatta - 8 volte, ecc. La concentrazione proteica viene calcolata moltiplicando la diluizione di 0,033 g / l.

Un anello bianco può formarsi quando c'è un gran numero di urati; a differenza delle proteine, appare leggermente al di sopra del confine di due liquidi e si dissolve quando è leggermente riscaldato.

Task numero 6. Determinazione della quantità di proteine ​​nelle urine con acido solfosalicilico al 3%

Il principio del metodo: la concentrazione di proteine ​​nelle urine è proporzionale alla torbidità che si verifica quando coagula l'acido sulfosalicilico

Piatti, attrezzature e reagenti:

Soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%;

Soluzione standard di albumina all'1% - 1 g di albumina liofilizzata (da siero umano o bovino) viene sciolta in una piccola quantità di soluzione di NaCl allo 0,9% in un matraccio con una capacità di 100 ml e quindi fatta colmare con lo stesso solvente. Il reagente viene stabilizzato aggiungendo 1 ml di soluzione di sodio azide al 5% (NaN 3). Se conservato in frigorifero, il reagente è stabile per 2 mesi.

Si introducono 1,25 ml di urina filtrata in una provetta, si aggiungono e si miscelano 3,75 mi di una soluzione di acido solfosalicilico al 3%. Dopo 5 minuti, il campione viene fotomposto su un PEC ad una lunghezza d'onda di 590-650 nm (filtro a luce arancione o rossa) contro il controllo in una cuvetta con una lunghezza del percorso ottico di 5 mm. Il controllo funge da campione in cui 3,75 ml di una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% vengono aggiunti a 1,25 ml di urina. La concentrazione di proteine ​​viene calcolata in base a un grafico di calibrazione, per la cui costruzione si preparano le diluizioni di una soluzione di albumina standard. (vedi tabella). Da ciascuna soluzione diluita ottenuta, 1,25 ml vengono prelevati e trattati come campioni sperimentali.

Preparazione delle diluizioni per tracciare la calibrazione

Soluzione standard, ml

Soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%, ml

Concentrazione di proteine, g / l

La dipendenza rettilinea della grandezza dell'estinzione e della concentrazione proteica è mantenuta fino a 1 g / l. A concentrazioni proteiche più elevate, il campione deve essere diluito e tenere conto della diluizione nel calcolo.

Se ci sono sostanze contenenti iodio nelle urine, si ottengono risultati falsi positivi. Pertanto, il test non può essere utilizzato in pazienti che assumono preparazioni di iodio o che sono stati sottoposti a ricerca utilizzando composti radiopachi contenenti iodio. Le reazioni J positive false durante lo studio possono essere causate dall'assunzione di farmaci sulfanilamide, dosi elevate di penicillina e ad alte concentrazioni nelle urine di acido urico.

Disegna uno schema per determinare la proteina

Task numero 7. Rilevazione di Bens-Jones nelle urine

Il principio del metodo: basato sulla reazione termoprecipitazione

Piatti, attrezzature e reagenti:

Reagente: tampone acetato 2M pH 4.9.

4 ml di urina filtrata vengono miscelati con 1 ml di soluzione tampone e scaldati per 15 minuti a bagnomaria a 56 ° C.

Interpretazione dei risultati:

In presenza di proteine ​​Bens-Jones nelle urine, nei primi 2 minuti appare un sedimento pronunciato.

Quando la concentrazione di proteine ​​è inferiore a 3 g / l, il campione può essere negativo, il che è piuttosto raro, poiché solitamente la concentrazione della proteina Bens-Jones nelle urine è molto significativa.

Il rilevamento più affidabile della proteina Bens-Jones è per precipitazione ad una temperatura di 40-60 ° C. Tuttavia, in presenza di urina troppo acida (pH inferiore a 3,0) o troppo alcalina (pH superiore a 6,5), con bassa densità relativa di urina e bassa concentrazione di Bens-Jones beige (inferiore a 3 g / l), la sedimentazione potrebbe non verificarsi.

Disegna uno schema per determinare la proteina

II modulo. Lavoro indipendente con la fase di ricerca

Task numero 1. Studiare e delineare l'applicazione №1 "Rilevazione delle proteine ​​mediante strisce reattive diagnostiche"

- Ottenere campioni di fluido biologico (urina) dall'insegnante, numerare i campioni;

- Effettuare un test delle urine utilizzando strisce reattive diagnostiche;

- Valuta il risultato (norma, patologia). Supponiamo che la causa delle proteine ​​nelle urine.

- Scrivi il risultato nei moduli di analisi, consegnali al docente.

"Rilevazione di proteine ​​mediante strisce reattive diagnostiche"

Principio. La proteina cambia il colore dell'indicatore applicato alla striscia. Gli indicatori sono confezionati in un set di 100 strisce, che sono conservate in un astuccio ben chiuso, in un luogo fresco e asciutto.

Regole per lavorare con strisce reattive diagnostiche

Quando si lavora con strisce reattive diagnostiche, è necessario osservare le seguenti regole:

- mantenere le strisce reattive diagnostiche in confezioni sigillate ben chiuse;

- conservare le casse in un luogo buio, asciutto e fresco a una temperatura non superiore a 30ºС, ma non nel frigorifero;

- Non esporre le strisce all'umidità e alla luce solare diretta, a temperature elevate e a sostanze chimiche volatili;

- ottenere solo il numero strettamente necessario di strisce e quindi chiudere immediatamente il caso;

- Non toccare le zone diagnostiche con le dita.

Regole del test

1. Per lo studio, usa l'urina del mattino raccolta in un contenitore di plastica per le urine usa e getta (o piatti puliti e asciutti). Mescoli l'urina consegnata, ma non centrifughi.

Quando si usano confezioni non standard, i residui di detersivo nel contenitore di raccolta delle urine causano risultati falsi.

2. Dal astuccio, prendere una striscia reattiva.

3. Chiudere immediatamente la custodia con il coperchio della fabbrica, proteggendo la striscia dall'umidità.

4. Abbassa le strisce di carta dell'indicatore per 2-3 secondi nelle urine esaminate e rimuovile immediatamente.

5. Per rimuovere l'umidità in eccesso dalle zone diagnostiche della striscia, eseguirla con un lungo bordo lungo il bordo del contenitore (o altro contenitore in cui viene erogata l'urina) o attaccare questo bordo della striscia per filtrare la carta.

È impossibile lavare l'eccesso di urina dalle zone diagnostiche.

6. Trascorso il tempo specificato sull'etichetta del contenitore o nelle istruzioni per ciascun test, scadere, confrontare il colore della zona diagnostica corrispondente con la scala del colore sull'etichetta del contenitore con strisce (standard). La procedura di test è mostrata nelle figure 1-7.

7. La reazione è valutata come positiva o negativa. O espresso numericamente in g / l. (vedi disegno №8).