ISTRUZIONI

sull'uso di un kit di reagenti per la determinazione colorimetrica delle proteine ​​nelle urine e nel liquido cerebrospinale con rosso pirogallolo

Il kit include:

200 ml (2 x 100 ml P + 2 x 2 ml calibratore)

500 ml (2 x 250 ml P + 2 x 5 ml calibratore)

Principio del metodo

Quando le proteine ​​interagiscono con il rosso pirogallolo e

il molibdato di sodio forma un complesso colorato,

la cui intensità del colore è proporzionale alla concentrazione

Contenuto del kit

Reagente (P) - soluzione di rosso pirogallolo in succinato

buffer pronto per l'uso.

Calibratori - Soluzioni proteiche a bassa calibrazione (0.20

g / l, usato per determinare la microproteinuria) e alto

(0,50 g / l, usato per determinare la proteinuria)

concentrazione proteica contenente il 70% di albumina e il 30%

globulina pronta all'uso.

Set di conservazione - a una temperatura di 2-8 ° C in un pacchetto

produttore per l'intera durata di conservazione.

Stabilità del reagente e dei calibratori

Dopo l'apertura, il reagente è stabile per 6 mesi, calibratori - 3 mesi. se conservato in forma ermeticamente chiusa a una temperatura di 2-8 ° C in un luogo buio.

Valori normali

• urina - fino a 0,120 g / l (fino a 0,141 g / giorno);
• liquido cerebrospinale (CSF) - 0,150-0,450 g / l.

Campioni per analisi

Urina, CSF non emolizzato.

Preparazione per l'analisi

1. CSF e urine centrifugate per 10 minuti a 2700-4000 giri al minuto.
2. Utilizzare le provette pulite e ben lavate per l'analisi. Il test per l'idoneità delle provette per l'analisi è l'assenza di un cambiamento di colore nel reagente. Se il reagente diventa blu senza aggiungere un campione, i risultati della determinazione delle proteine ​​saranno sovrastimati; quindi, dispensare prima il reagente e quindi aggiungere l'urina.
3. Quando si imposta il metodo, devono essere utilizzate nuove cuvette, poiché non sono macchiate con il reagente e il campione di reazione. Le vecchie cuvette di plastica (torbide, non trasparenti) non sono adatte per la misurazione. Prima dell'uso, trattare le cuvette in uso come segue: lasciare per 10 minuti nella soluzione di lavaggio (200 ml di soluzione di perossido di idrogeno al 5% o 1 ml di detergente), quindi risciacquare con acqua corrente e acqua distillata almeno 10 volte. Il kit è adatto per analisi su analizzatori semiautomatici e automatici biochimici.

Analisi Lunghezza d'onda: 598 (578-620) nm; lunghezza del percorso ottico: 10 mm; temperatura: 18-25 ° C.

Il reagente e il calibratore devono essere conservati a temperatura ambiente per circa 30 minuti prima dell'analisi.

Procedura 1 (determinazione della proteinuria)

Campioni da miscelare, conservare per 10 minuti a temperatura ambiente (18-25 ° C). Misurare la densità ottica dei campioni sperimentale (E) e di calibrazione (CE) rispetto al campione di controllo (bianco). Il colore è stabile per 1 ora.

COSA FACCIAMO MISURARE NEL METODO SUL SOLFOSALYCYL DELL'URINA?

Nel nostro paese, un metodo turbidimetrico che utilizza un acido sulfosalicilico (metodo sulfosalicilico), che è stato proposto per la prima volta da Kingsbury F, è utilizzato principalmente per determinare la concentrazione di proteine ​​nelle urine. B. e coautori nel 1926. Allo stesso tempo, i laboratori dei paesi sviluppati praticamente non usano questo metodo, di conseguenza il controllo di qualità del laboratorio sull'analisi delle proteine ​​urinarie mostra una diminuzione del coefficiente di variazione. Così, nel 1993, il 60% dei laboratori diagnostici francesi ha eseguito la determinazione della concentrazione di proteine ​​nelle urine utilizzando un metodo colorimetrico usando il colorante rosso pirogallolo (metodo pirogallolo) e solo il 10% utilizzando il metodo sulfosalicilico. I kit diagnostici per la determinazione delle proteine ​​urinarie basate sul metodo del pirogallolo sono prodotti da società note come Bayer D iagnostics, Beckman, Biodirect, Biocon Diagnostik, Bio-Rad Laboratories, Eurodiag, Kone, Merck, Randox, Serono, Sentinel CH, Sigma. Purtroppo, nel nostro paese, per ragioni economiche e in parte a causa della mancanza di esperienza, i metodi colorimetrici per determinare le proteine ​​urinarie sono ancora poco utilizzati.

Sorge la domanda: quanto è giustificato il rifiuto dei laboratori dei paesi sviluppati di utilizzare il metodo semplice e, soprattutto, economico. Per chiarire questo problema, abbiamo confrontato i risultati della determinazione della concentrazione di proteine ​​nelle urine dei pazienti con due metodi: solfosalicilico [1] e pirogallolo [2].

La procedura per misurare la concentrazione della proteina per ciascun metodo era la seguente.

Reattivi: soluzione di acido solfosalicilico al 3%, soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%,

Calibratore (soluzione di calibrazione dell'albumina sierica, 50 g / l, in soluzione di cloruro di sodio, 0,9% e sodio azide, 0,095%) dal kit "Uni-Test - Total Protein" prodotto da "Diakon DS" per ordine di "A / A proposito di Unimed ".

Equipaggiamento: spettrofotometro SF-2000 prodotto da OKB "Spectr".

Corso di misurazione: 0,5 ml di urina filtrata e 1,5 ml di una soluzione di acido solfosalicilico al 3% sono stati aggiunti a una cuvetta di quarzo con una lunghezza del cammino ottico di 1 cm e agitati. Dopo 10 minuti, la densità ottica è stata misurata su uno spettrofotometro ad una lunghezza d'onda di 595 nm contro un campione bianco (cuvetta con 0,5 ml di urina e 1,5 ml di soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%). Il calcolo della concentrazione di proteine ​​è stato eseguito secondo il programma di calibrazione. Per la sua costruzione, diluizioni di una soluzione standard di albumina di siero umano in soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% con concentrazioni di: 0,025; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 g / l. Per ciascuna delle soluzioni preparate, la misurazione è stata eseguita allo stesso modo di un campione di urina. Il grafico di calibrazione è mostrato in Fig.1.

Fig. 1. Curva di calibrazione per la determinazione delle proteine ​​nelle urine mediante metodo solfosalicilico.

Un kit commerciale prodotto da Biocon Diagnostik (Germania) - Fluitest USP - È stato utilizzato un metodo proteico, un metodo ultra-sensibile basato sul complesso rosso pirogallolo-molibdato.

Reagenti: rosso pirogallolo, 0,06 mmol / l, sodio molibdato, 0,04 mmol / l, tampone succinato 50 mmol / l, pH 2,5, detergenti 2%; Calibratore (soluzione di calibrazione dell'albumina sierica, 50 g / l, in soluzione di cloruro di sodio, 0,9% e sodio azide, 0,095%) dal kit "Uni-Test - Total Protein" prodotto da "Diakon DS" per ordine di "A / A proposito di Unimed ". [3].

Equipaggiamento: fotometro biochimico StatFax 1904 Plus ("Awareness Technology inc.", USA).

La curva di calibrazione per il metodo descritto con il rapporto di campione / reagente - 1 / 12,5 è stata ottenuta utilizzando soluzioni appositamente preparate di albumina sierica: 0,05; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0, g / l diluendo il calibratore (50 g / l) con soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%, (Fig.2).

Fig. 2. Curva di calibrazione per il metodo rosso pirogallolo, reagente USP Fluitest, Biocon Diagnostik (Germania) con un rapporto campione / reagente di 1 / 12,5.

80 μl sono stati prelevati da ciascuna soluzione proteica e miscelati con 1,0 ml di reagente; misurati come campioni di urina.

Fig. 3. Un diagramma della comparabilità dei risultati della misurazione del contenuto proteico nei campioni di urina mediante metodi sulfosalicilico e pirogallolo.

La curva di calibrazione per il reagente prodotto da Unimed A / O e Biocon Diagnostik, con un rapporto campione / reattivo di 1/30, è stata ottenuta utilizzando soluzioni appositamente preparate di albumina sierica: 0,05; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1.0, 1.1; 1.2; 1.3; 1.4; 1.5; 1.6; 1.7; 1,75; 1.8; 1,85; 1.9; 2,0 g / l diluendo il calibratore (50 g / l) con soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% (Fig.4).

Fig. 4. Curve di calibrazione per il reagente Unimed A / O (grafico superiore) e Fluitest USP kit di Biocon Diagnostik (grafico inferiore) con un rapporto campione / reattivo di 1/30.

50 μl sono stati prelevati da ciascuna soluzione proteica e miscelati con 1,5 ml di reagente e misurati come campioni di urina.

Nello studio, per ottenere la massima sensibilità del metodo pirogallolo, è stata utilizzata la sua variante altamente sensibile modificata. Per questo, il volume di urina aggiunto è stato aumentato. Corso di misura: 1 ml del reagente principale è stato aggiunto a tutte le provette, poi 80 μl di acqua distillata (bianco) sono stati aggiunti alla prima provetta, 80 ul di urina centrifugata sono stati aggiunti alle rimanenti provette, incubate a temperatura ambiente per 10 minuti e la densità ottica del campione è stata misurata contro il bianco Lunghezza d'onda 600 nm e filtro differenziale 650 nm

Per comparare i metodi per determinare la concentrazione di proteine ​​nelle urine, sono stati misurati 60 campioni di urina di pazienti con metodi sulfosalicilico e pirogallolo.

La sensibilità dei metodi per misurare la proteina nelle urine è stata valutata esaminando soluzioni acquose di urina preparate contenenti basse concentrazioni di albumina sierica (da 0 a 0,05 g / l). Per i metodi pirogallolo e sulfosalicilico, abbiamo anche studiato i valori dell'assorbimento non specifico dovuto al colore del campione di urina. Per questo, è stata misurata la densità ottica dei campioni di urina, in cui, invece di acido solfosalicilico o reagente pirogallolo, è stata aggiunta una quantità equivalente di soluzione salina.

Per valutare l'effetto della matrice (urina) sui risultati del metodo sulfosalicilico, sono stati eseguiti i seguenti esperimenti.

1) Nei campioni di urina non contenenti proteine, secondo i metodi pirogallolo e solfosalicilico (n = 43), è stata aggiunta albumina di siero umano ad una concentrazione finale di 0,4 g / l. Quindi, utilizzando i metodi precedenti, è stata determinata la concentrazione di proteine ​​nei campioni preparati.

2) I campioni di urina (n = 16), aventi una proteina secondo il metodo del pirogallolo, sono stati diluiti due volte con una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%. I campioni ottenuti sono stati riesaminati con il metodo sulfosalicilico, la concentrazione di proteine ​​è stata ricalcolata per la diluizione.

Risultati della ricerca e discussione

Uno studio su campioni di urina contenenti concentrazioni specifiche di albumina ha mostrato che la concentrazione minima di albumina rilevabile (sensibilità del metodo) era di 0,033 g / l per il metodo sulfosalicilico e 0,012 g / l per il metodo del pirogallolo.

I risultati delle misurazioni sotto forma di un diagramma di comparabilità dei risultati della misurazione del contenuto proteico nei campioni di urina da parte del solfosalicilico (asse delle ordinate) e del pirogallolo (asse dell'ascissa) sono mostrati in Fig. 3. La linea obliqua solida sul grafico corrisponde all'uguaglianza dei risultati della misurazione con due metodi. Se entrambi i metodi davano valori simili, i punti sul grafico dovrebbero essere raggruppati vicino alla linea continua. I dati mostrati in Fig. 3, possiamo anche notare che il metodo sulfosalicilico ha mostrato costantemente concentrazioni proteiche più basse in tutti i campioni di urina rispetto al metodo del pirogallolo.

Come lo studio ha dimostrato, tra i risultati ottenuti con metodi sulfosalicilico e pirogallolo, non esiste una connessione statistica convincente. Inoltre, rispetto al metodo del pirogallolo, il metodo sulfosalicilico nel 95% dei campioni di urina ha mostrato valori più bassi di concentrazione proteica. Allo stesso tempo, nell'86% dei casi, la misurazione mediante il metodo sulfosalicilico ha dato risultati sottostimati di due o più volte rispetto al metodo del pirogallolo.

Allo stesso tempo, il metodo sulfosalicilico in alcuni casi ha mostrato la presenza di proteine ​​nel campione a causa del colore scuro o aumento della torbidità delle urine studiate. È stato stabilito che nel determinare la proteina mediante il metodo solfosalicilico (rapporto campione / reagente = 1/3) ad una lunghezza d'onda di 595 nm, il contributo del campione di urina dovuto al suo colore o torbidità al risultato può essere compreso tra 0 e 0,247 g / l (valore medio - 0,031 g / l). Pertanto, si dovrebbe riconoscere che quando si utilizza il metodo sulfosalicilico, è obbligatorio l'uso di un campione di controllo (campione di urina + soluzione salina) per ciascun campione di urina. Nel determinare la proteina con il metodo pirogallolo, il colore o il grado di torbidità del campione di urina non ha influenzato il risultato.

L'esperimento sulla valutazione dell'effetto della matrice (urina) ha mostrato che in quasi tutti i campioni di urina preparati contenenti 0,4 g / l di albumina, la sua concentrazione, determinata dal metodo solfo-salicilico, era inferiore a 0,4 g / l in media del 20% (valori borderline concentrazione proteica 0,29-0,34 g / l). Allo stesso tempo, misurando la concentrazione di proteine ​​in questi campioni con il metodo pyrogallol, i risultati per tutti i campioni erano nell'intervallo 0,40-0,46 g / l. Inoltre, nel valutare l'effetto della matrice (urina) sui risultati della misurazione della concentrazione di proteine ​​mediante il metodo solfosalicilico, è stato riscontrato che in 5 su 16 campioni di urina doppiamente diluiti la concentrazione proteica era del 15-33% superiore rispetto ai corrispondenti campioni non diluiti. Per la delucidazione finale dell'effetto della matrice sui risultati del metodo solfosalicilico, è richiesta una ricerca su un gran numero di campioni di urina.

Pertanto, i dati ottenuti indicano i vantaggi del metodo pirogallolo rispetto al metodo solfosalicilico a causa della sua maggiore sensibilità e non suscettibilità ai fattori interferenti, nessuna necessità di un campione di urina, la possibilità di utilizzare uno standard per costruire una curva di calibrazione e una piccola quantità di urina per l'analisi. La presenza di tali caratteristiche ci consente di raccomandare il metodo pirogallolo per l'uso diffuso nella pratica di laboratorio.

Dai dati ottenuti, segue una conclusione: i risultati della misurazione della concentrazione di proteine ​​nelle urine mediante il metodo sulfosalicilico non sono confrontabili con i risultati ottenuti con il metodo del pirogallolo. Questo fatto è la risposta alla domanda: perché i laboratori dei paesi sviluppati non usano il metodo sulfosalicilico. L'applicazione di questo metodo nei paesi sottosviluppati, a quanto pare, è spiegata dal fatto che lì il fattore prezzo prevale sull'accuratezza e la significatività diagnostica dei risultati ottenuti e, date le cifre presentate in fig. 3 risultati, si può dire, e sopra il buon senso. Chi ha bisogno di tale analisi, quando a una concentrazione di proteine ​​nell'urina di 0,3 g / l, il risultato della misurazione può variare da 0,05 a 0,25 g / l? Per quanto riguarda il fattore prezzo, quindi, come sai, l'avaro paga due volte. I risultati errati dell'analisi portano a una diagnosi errata e ad un trattamento inefficace del paziente. Il principale pericolo di utilizzare il metodo sulfosalicilico è che otteniamo valori significativamente sottovalutati e raramente manca la proteinuria. Pertanto, questo metodo non può essere applicato anche per lo screening.

Quindi cosa misuriamo con il metodo solfosalicilico? Il metodo appartiene alla classe del turbidimetrico, basato sulla misurazione della variazione della trasmissione luminosa (D D) della miscela di reazione dovuta alla diffusione della luce (torbidità). Nel caso del rilevamento di proteine ​​nelle urine, si forma torbidità a causa del seguente processo: le molecole di proteine ​​urinarie in un mezzo acido vengono denaturate, passando da una forma globulare compatta a una forma "filamentosa". Allo stesso tempo, la capacità della formazione di conglomerato aumenta nettamente (reazione di precipitazione) nelle proteine. Le singole molecole proteiche sono più piccole della lunghezza d'onda della luce visibile e quindi la disperde molto debolmente. L'efficienza di scattering aumenta drammaticamente quando le dimensioni dei conglomerati risultanti delle molecole proteiche si avvicinano al valore di 0,6 μm (la lunghezza d'onda della luce di sondaggio). Maggiore è la concentrazione di proteine ​​nelle urine, maggiore è il numero di tali conglomerati (centri di diffusione). Tuttavia, la relazione tra la densità ottica D D misurata su un fotometro e la concentrazione di proteine ​​nelle urine è molto complessa. Nella fase iniziale della reazione, si formano una certa quantità di piccole particelle proteiche, quindi iniziano ad aderire insieme in particelle più grandi, mentre la concentrazione dei centri di dispersione diminuisce e l'efficienza (sezione trasversale) della dispersione di ciascun centro aumenta. In qualsiasi momento, nella miscela di reazione abbiamo un certo numero di centri di dispersione con dimensioni diverse. Ad alte concentrazioni di proteine ​​nelle urine si possono formare grandi particelle proteiche che precipitano, il che porta ad una diminuzione della densità ottica della miscela di reazione.

Il processo di denaturazione delle proteine ​​e la reazione di precipitazione dipendono dalla composizione del mezzo in cui si verificano (pH, concentrazione di vari sali). Per calibrare il metodo, usiamo una soluzione acquosa di albumina umana con l'aggiunta di cloruro di sodio allo 0,9%. Quando misuriamo la concentrazione di proteine ​​nelle urine, non sappiamo e non prendiamo in considerazione né il pH delle urine né la sua composizione salina. Inoltre, non teniamo conto del fatto che diverse proteine ​​reagiscono in modo diverso nella soluzione di acido solfosalicilico. Questo spiega la grande dispersione dei risultati di misurazione presentati in Fig. 3. Più la composizione dell'urina si avvicina alla composizione del calibratore, più accurato è il risultato della misurazione. Tuttavia, ci sono pochissimi campioni di questo tipo di urina. Nella maggior parte dei casi, la composizione dell'urina è tale che i risultati della misurazione sono sottostimati e spesso piuttosto significativi.

Quest'ultimo è confermato dall'esperimento sopra descritto, in cui la concentrazione della proteina è stata misurata con il metodo solfosalicilico in campioni di urina diluiti e diluiti doppiamente. Il confronto dei dati ottenuti ha mostrato che la diluizione delle urine (tenendo conto del grado di diluizione) porta ad un aumento dei risultati delle misurazioni della concentrazione proteica del 15-33%. Questo fatto conferma l'influenza significativa della composizione dell'urina sul risultato della determinazione della concentrazione di proteine ​​(effetto matrice).

Perché il metodo pyrogallol consente di ottenere risultati più accurati di misurazione della concentrazione di proteine ​​nelle urine? In primo luogo, a causa della maggiore molteplicità di diluizione dei campioni di urina nella miscela di reazione. Se nel metodo solfosalicilico il rapporto del campione / reagente urinario è 1/3, nel metodo pirogallolo può essere compreso tra 1 / 12,5 e 1/60, a seconda della variante della tecnica, che riduce significativamente l'effetto della composizione dell'urina sul risultato della misurazione. In secondo luogo, la reazione procede in tampone succinato, cioè a pH stabile. E infine, il principio stesso del metodo, se può essere detto così, è più trasparente. Il molibdato di sodio e il colorante rosso pirogallolo formano un complesso con una molecola proteica. Ciò porta al fatto che le molecole di colorante, in uno stato libero, non assorbono la luce ad una lunghezza d'onda di 600 nm, in combinazione con una proteina, assorbono la luce. Quindi, sembriamo marcare ogni molecola proteica con un colorante e come risultato scopriamo che il cambiamento nella densità ottica della miscela di reazione ad una lunghezza d'onda di 600 nm è univocamente correlato alla concentrazione proteica nelle urine.

In conclusione, le differenze più significative tra il metodo sulfosalicilico per la determinazione della proteina nelle urine e il metodo che utilizza il colorante rosso pirogallolo sono presentate nella Tabella n. 1.

Tab. No. 1. Caratteristiche comparative di due metodi per determinare la proteina nelle urine (metodi sulfosalicilico e pirogallolo)

Determinazione delle proteine ​​delle urine con rosso pirogallolo

Il principio del metodo si basa sulla misurazione fotometrica della densità ottica di una soluzione di un complesso colorato formata dall'interazione di molecole proteiche con molecole del complesso colorante rosso pirogallolo e molibdato di sodio (complesso Pyrogallol Red-Molibdato) in un mezzo acido. L'intensità del colore della soluzione è proporzionale al contenuto di proteine ​​nel materiale in esame. La presenza di detergenti nel reagente fornisce una definizione equivalente di proteine ​​di diversa natura e struttura.

Reagenti. 1) 1,5 mmol / l di pyrogallol red (PGA): 60 mg di PGA vengono sciolti in 100 ml di metanolo. Conservare a temperatura 0-5 ° С; 2) soluzione tampone di 50 mmol / l di succinato pH 2,5: 5,9 g di acido succinico (HOOC - CH₂CH₂-COOH); 0,14 g di ossalato di sodio (Na₂C₂O₄) e 0,5 g di benzoato di sodio (C₆H₅COONa) viene sciolto in 900 ml di acqua distillata; 3) 10 mmol / l soluzione di sodio molibdato cristallatoidrato (Na₂MoO₄ × 2H₂O): 240 mg di sodio molibdato vengono sciolti in 100 ml di acqua distillata; 4) Reagente di lavoro: a 900 ml di soluzione tampinata di succinato aggiungere 40 ml della soluzione di PHC e 4 ml di soluzione di molibdato di sodio. Il pH della soluzione viene regolato a 2,5 con una soluzione 0,1 mol / l di acido cloridrico (HCl) e il suo volume è regolato a 1 l. Il reagente in questa forma è pronto per l'uso ed è stabile se conservato in un luogo buio ea una temperatura di 2-25 ° C per 6 mesi; 5) Soluzione di albumina standard da 0,5 g / l.

Il corso della determinazione. Nella prima provetta vengono introdotti 0,05 ml di urina studiata, 0,05 ml di soluzione standard di albumina vengono aggiunti alla seconda provetta e 0,05 ml di acqua distillata alla terza provetta (campione di controllo), quindi a queste provette vengono aggiunti 3 ml di reagente di lavoro. Il contenuto delle provette viene miscelato e dopo 10 minuti, il campione e lo standard vengono fotomettati su un campione di controllo a una lunghezza d'onda di 596 nm in una cuvetta con una lunghezza del cammino ottico di 10 mm.

Il calcolo della concentrazione di proteine ​​nel campione di urina analizzato viene effettuato secondo la formula:

dove C è la concentrazione di proteine ​​nel campione di urina analizzato, g / l; la_eccetera e a_articolo- estinzione del campione di urina studiato e soluzione standard di albumina, g / l; 0,5 - concentrazione di soluzione di albumina standard, g / l.

• il colore della soluzione (complesso di colori) è stabile per un'ora;
• la relazione direttamente proporzionale tra la concentrazione di proteine ​​nel campione e l'assorbimento della soluzione dipende dal tipo di fotometro;
• quando il contenuto proteico nelle urine è superiore a 3 g / l, il campione viene diluito con soluzione isotonica di cloruro di sodio (9 g / l) e la determinazione viene ripetuta. Il grado di diluizione viene preso in considerazione quando si determina la concentrazione di proteine.

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Determinazione del pirogallolo rosso delle proteine ​​nelle urine

26.02.2009

Kurilyak O.A., Ph.D.

Normalmente, la proteina viene escreta nelle urine in una quantità relativamente piccola, di solito non superiore a 100-150 mg / die.

La diuresi giornaliera in una persona sana è 1000-1500 ml / giorno; pertanto, la concentrazione proteica in condizioni fisiologiche è di 8-10 mg / dl (0,08-0,1 g / l).

La proteina urinaria totale è rappresentata da tre frazioni principali: albumina, mucoproteine ​​e globuline.

L'albumina di urina è la porzione di albumina sierica che è stata filtrata nei glomeruli e non è stata riassorbita nei tubuli renali; nella normale escrezione di albumina nelle urine è inferiore a 30 mg / die. Un'altra importante fonte di proteine ​​nelle urine sono i tubuli renali, in particolare la parte distale dei tubuli. Questi tubuli secernono due terzi della quantità totale di proteine ​​urinarie; di questa quantità, circa il 50% è rappresentato dalla glicoproteina Tamm-Horsfall, che è secreta dall'epitelio dei tubuli distali e svolge un ruolo importante nella formazione dei calcoli urinari. Altre proteine ​​sono presenti nelle urine in piccole quantità e provengono da proteine ​​plasmatiche a basso peso molecolare filtrate attraverso il filtro renale, che non vengono riassorbite nei tubuli renali, le microglobuline dall'epitelio dei tubuli renali (RTE), così come le secrezioni prostatiche e vaginali.

La proteinuria, cioè un aumento del contenuto proteico nelle urine è uno dei sintomi più significativi, che riflette il danno renale. Tuttavia, una serie di altre condizioni può anche essere accompagnata da proteinuria. Pertanto, ci sono due gruppi principali di proteinuria: proteinuria renale (vera) ed extrarenale (falsa).

Nella proteinuria renale, la proteina entra nell'urina direttamente dal sangue a causa di un aumento della permeabilità del filtro glomerulare. La proteinuria renale si trova spesso in glomerulonefrite, nefrosi, pielonefrite, nefrosclerosi, amiloidosi renale, varie forme di nefropatia, ad esempio nefropatia delle donne in gravidanza, febbre, ipertensione, ecc. La proteinuria può anche essere trovata in persone sane dopo uno sforzo fisico grave, ipotermia e stress psicologico. Nei neonati, la proteinuria fisiologica si osserva nelle prime settimane di vita e quando l'astenia si verifica nei bambini e negli adolescenti, la proteinuria ortostatica (nella posizione eretta del corpo) è possibile in combinazione con una rapida crescita tra i 7 ei 18 anni.

In caso di proteinuria falsa (extrarenale), la fonte di proteine ​​nelle urine è una miscela di leucociti, eritrociti, cellule epiteliali del tratto urinario dell'uretra. Il decadimento di questi elementi, particolarmente pronunciato con l'urina alcalina, porta all'ingresso di proteine ​​nelle urine, che ha già superato il filtro renale. Il grado particolarmente elevato di falsa proteinuria dà sangue nelle urine, con abbondante ematuria, può raggiungere 30 g / le più. Malattie che possono essere accompagnate da proteinuria extrarenale - urolitiasi, tubercolosi renale, tumori renali o del tratto urinario, cistite, pielite, prostatite, uretrite, vulvovaginite.

La classificazione clinica include lieve proteinuria (meno di 0,5 g / die), moderata (da 0,5 a 4 g / die), o grave (oltre 4 g / die).

La maggior parte dei pazienti con malattia renale, come glomerulonefrite acuta o pielonefrite, rivela una moderata proteinuria, ma i pazienti con sindrome nefrosica solitamente espellono più di 4 g di proteine ​​nelle urine al giorno.

Per la determinazione quantitativa della proteina, viene utilizzata un'ampia gamma di metodi, in particolare il metodo unificato Brandberg-Roberts-Stolnikov, il metodo biuret, il metodo dell'acido solfosalicilico, i metodi che utilizzano la tintura blu Coomassie, la tintura rossa pirogallolica, ecc.

L'uso di vari metodi per determinare la proteina nelle urine ha portato ad una seria confusione nell'interpretazione dei limiti della norma del contenuto proteico nelle urine. Dal momento che il metodo di laboratorio più comunemente usato 2 - con acido salicilsolfonico e colorante rosso pirogallolo, prendere in considerazione il problema della correttezza dei confini delle regole per loro. Dal punto di vista del metodo solfosalicilico nel normale contenuto proteico urina non deve superare 0,03 g / l, con la stessa posizione pirogallolo - 0,1 g / l! Le differenze sono tre.

Valori bassi della concentrazione normale di proteine ​​nelle urine quando si utilizza sulfosalicilico a causa dei seguenti punti:

• la curva di calibrazione è basata su una soluzione acquosa di albumina. L'urina nella sua composizione è molto diversa dall'acqua: pH, sale, composti a basso peso molecolare (creatinina, urea, ecc.). Di conseguenza, secondo Altshuler, Rakov e Tkachev, un errore nel determinare le proteine ​​delle urine può essere 3 volte o più! ie i risultati corretti possono essere ottenuti solo nei casi in cui l'urina ha un peso specifico molto basso e la sua composizione e il pH si avvicinano all'acqua;
• la maggiore sensibilità del metodo solfosalicilico all'albumina rispetto ad altre proteine ​​(in quel momento, come detto sopra, l'albumina nei normali campioni di urina non rappresenta più del 30% della proteina urinaria totale);
• se il pH delle urine viene spostato sul lato alcalino, l'acido sulfosalicilico viene neutralizzato, il che provoca anche una diminuzione dei risultati della determinazione delle proteine;
• il tasso di sedimentazione dei precipitati è soggetto a variazioni significative - a basse concentrazioni di proteine, le precipitazioni sono rallentate e la cessazione anticipata della reazione porta a una sottostima del risultato;
• la velocità di reazione alla precipitazione dipende essenzialmente dalla miscelazione della miscela di reazione. Ad alte concentrazioni di proteine, il vigoroso scuotimento del tubo può portare alla formazione di grosse scaglie e alla loro rapida precipitazione.

Tutte le caratteristiche sopra elencate del metodo portano ad una significativa sottostima della concentrazione proteica determinata nelle urine. Il grado di sottosegnalazione dipende fortemente dalla composizione di un particolare campione di urina. Poiché il metodo dell'acido solfosalicilico fornisce un valore sottovalutato della concentrazione di proteine, il limite normale per questo metodo è di 0,03 g / l, circa tre volte troppo basso rispetto ai dati forniti nei libri di riferimento stranieri sulla diagnostica di laboratorio clinica.

La grande maggioranza dei laboratori nei paesi occidentali ha abbandonato l'uso del metodo sulfosalicilico per determinare la concentrazione di proteine ​​nelle urine e usa attivamente il metodo del pirogallolo per questo scopo. Il metodo pyrogallol per determinare la concentrazione proteica nelle urine e in altri fluidi biologici si basa sul principio fotometrico della misurazione della densità ottica di un complesso colorato formato dall'interazione di molecole proteiche con colorante rosso pirogallolo e molecole complesse di sodio molibdato (complesso Pyrogallol Red - Molibdato).

Perché il metodo pyrogallol consente di ottenere risultati più accurati di misurazione della concentrazione di proteine ​​nelle urine? In primo luogo, a causa della maggiore molteplicità di diluizione dei campioni di urina nella miscela di reazione. Se nel metodo solfosalicilico il rapporto del campione / reagente urinario è 1/3, nel metodo pirogallolo può essere compreso tra 1 / 12,5 e 1/60, a seconda della variante della tecnica, che riduce significativamente l'effetto della composizione dell'urina sul risultato della misurazione. In secondo luogo, la reazione procede in tampone succinato, cioè a pH stabile. E, infine, il principio stesso del metodo può dirsi più "trasparente". Il molibdato di sodio e il colorante rosso pirogallolo formano un complesso con una molecola proteica. Ciò porta al fatto che le molecole di colorante allo stato libero che non assorbono la luce ad una lunghezza d'onda di 600 nm in combinazione con una proteina assorbono la luce. Quindi, sembriamo marcare ogni molecola proteica con un colorante e, di conseguenza, vediamo che il cambiamento nella densità ottica della miscela di reazione ad una lunghezza d'onda di 600 nm è chiaramente correlato con la concentrazione proteica nelle urine. Inoltre, poiché l'affinità del rosso pirogallolo con diverse frazioni proteiche è pressoché la stessa, il metodo consente di determinare la proteina urinaria totale. Pertanto, il limite dei valori normali di concentrazione di proteine ​​nelle urine è 0,1 g / l (è indicato in tutte le moderne linee guida occidentali per la diagnostica clinica e di laboratorio, incluso il Manuale clinico per i test di laboratorio, edito da N. Tits). Le caratteristiche comparative dei metodi pirogallolo e solfosalicilico per la determinazione delle proteine ​​urinarie sono presentate nella Tabella 1.

In conclusione, vorrei soffermarmi ancora una volta sul fatto che quando il laboratorio passa dal metodo solfosalicilico per determinare la proteina urinaria al metodo pirogallolo, il limite dei valori normali aumenta in modo significativo (da 0,03 g / l a 0,1 g / l!). Questo personale di laboratorio dovrebbe sicuramente informare i medici, perché In questa situazione, la diagnosi di proteinuria può essere fatta solo nel caso in cui il contenuto proteico nelle urine superi 0,1 g / l.

3. Determinazione della proteina.

Principio del metodo basato sulla coagulazione delle proteine ​​nelle urine in presenza di acido nitrico (o soluzione al 20% di acido sulfosalicilico).

Progresso del lavoro: a 5 gocce di urina aggiungere 1-2 gocce di acido nitrico (o solfosalicilico). In presenza di proteine ​​nelle urine appare torbidità.

Tabella. Rilevazione di componenti patologici di urina.

Nota: in presenza di glucosio e proteine ​​nell'urina esaminata, viene determinato il loro contenuto quantitativo.

Determinazione quantitativa della proteina nelle urine mediante il metodo colorimetrico con rosso pirogallolo.

Principio del metodo: Complesso colorato è formato, l'intensità di colore, che è proporzionale alla concentrazione della proteina nel campione ad un'interazione proteina con pirogallolo molibdato rosso e sodio.

reagenti: Reagente di lavoro - soluzione di rosso pirogallolo in tampone succinato, soluzione proteica di calibrazione con una concentrazione di 0,50 g / l

I campioni si mescolano e rimangono per 10 minuti. a temperatura ambiente (18-25 ° C). Misurare la densità ottica sperimentata (D_op) e campione di calibrazione (D_a) rispetto al campione di controllo in λ = 598 (578-610) nm. La colorazione è stabile per 1 ora.

calcolo: la concentrazione di proteine ​​nell'urina (C) g / l è calcolata con la formula:

Valori normali: fino a 0,094 g / l (0,141 g / giorno)

Determinazione quantitativa del glucosio nelle urine con il metodo della glucosio ossidasi.

Principio del metodo: Quando il D-glucosio viene ossidato dall'ossigeno atmosferico sotto l'azione della glucosio ossidasi, si forma una quantità equimolare di perossido di idrogeno. Sotto l'azione della perossidasi, il perossido di idrogeno ossida i substrati cromogeni (una miscela di fenolo e 4 aminoantipirina - 4 ° P) con la formazione di un prodotto colorato. L'intensità del colore è proporzionale al contenuto di glucosio.

2 N₂oh₂ + fenolo + 4 ° P composto colorato + 4N₂oh

Progresso del lavoro: 1 ml della soluzione di lavoro e 0,5 ml di tampone fosfato vengono introdotti in due provette. Alla prima provetta vengono aggiunti 0,02 ml di urina e al secondo si aggiungono 0,02 ml del calibratore (calibrazione, soluzione standard di glucosio, 10 mmol / l). I campioni vengono miscelati, incubati per 15 minuti ad una temperatura di 37 ° C in un termostato e la densità ottica viene misurata sperimentalmente (D_op) e calibrazione (D_a) campioni contro il reagente di lavoro ad una lunghezza d'onda di 500-546 nm.

Il contenuto di glucosio nell'urina giornaliera è determinato da mmol / die moltiplicando il risultato ottenuto dal volume di urina raccolta al giorno.

Nota. Quando il contenuto di zucchero nelle urine supera l'1% deve essere diluito.

Attualmente, i laboratori biochimici usano un metodo espresso unificato per analizzare l'urina per il glucosio usando il test del glucosio reattivo al glucosio o usando strisce reattive combinate per pH, proteine, glucosio, corpi chetonici e sangue. Strisce reattive, immerse in una nave con urina per 1 secondo. e confrontare il colore sulla scala.

Dottore Epatite

trattamento del fegato

Norma proteina nel metodo dell'urina pirogallolo

Una persona sana produce 1,0-1,5 litri di urina al giorno. Un contenuto di 8-10 mg / dl di proteine ​​in esso è un fenomeno fisiologico. L'assunzione giornaliera di proteine ​​nelle urine 100-150 mg non dovrebbe causare sospetto. Globulina, mucoproteina e albumina sono ciò che costituisce la proteina totale nelle urine. Un grande deflusso di albumina indica una violazione del processo di filtrazione nei reni ed è chiamato proteinuria o albuminuria.

Ad ogni sostanza presente nelle urine viene attribuita una percentuale "sana" e, se l'indice delle proteine ​​fluttua, ciò può indicare una patologia dei reni.

L'analisi delle urine comporta l'uso della prima porzione (mattutina) o di un campione giornaliero. Quest'ultimo è preferibile per valutare il livello di proteinuria, dal momento che il contenuto di proteine ​​ha pronunciato fluttuazioni giornaliere. L'urina durante il giorno viene raccolta in un contenitore, misura il volume totale. Per un laboratorio che esegue analisi delle proteine ​​delle urine, un campione standard (da 50 a 100 ml) da questo contenitore è sufficiente, la quantità rimanente non è richiesta. Per ulteriori informazioni, viene effettuato un test supplementare su Zimnitsky, che mostra se gli indicatori delle urine al giorno sono normali.

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La proteina nelle urine è normale in un adulto non deve superare 0,033 g / l. Allo stesso tempo, la tariffa giornaliera non è superiore a 0,05 g / l. Per le donne incinte, il tasso di proteine ​​nelle urine giornaliere è più - 0,3 g / l., E al mattino l'urina è la stessa - 0,033 g / l. Gli standard di proteine ​​differiscono nell'analisi generale dell'urina e nei bambini: 0,036 g / l per la porzione mattutina e 0,06 g / l al giorno. Molto spesso, i laboratori effettuano un'analisi utilizzando due metodi, che mostrano la quantità di frazione proteica contenuta nell'urina. I valori normali sopra indicati sono validi per l'analisi effettuata con acido sulfosalicilico. Se si utilizzava colorante rosso pirogallolo, i valori saranno tre volte diversi.

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La causa della proteina nelle urine può essere processi patologici nei reni:

• la filtrazione nei glomeruli renali va nel modo sbagliato;
• l'assorbimento nei tubuli proteici è compromesso;
• Alcune malattie hanno un forte carico sui reni - quando la proteina nel sangue è elevata, i reni semplicemente non hanno il tempo di filtrarlo.

I restanti motivi sono considerati non reni. Ecco come si sviluppa l'albuminuria funzionale. La proteina nell'analisi delle urine appare in reazioni allergiche, epilessia, insufficienza cardiaca, leucemia, avvelenamento, mieloma, chemioterapia, malattie sistemiche. Molto spesso, questo indicatore nelle analisi dei pazienti sarà la prima campana della malattia ipertensiva.

Un aumento delle proteine ​​urinarie può essere dovuto a fattori di natura non patologica, quindi saranno necessarie analisi aggiuntive.

I metodi quantitativi per determinare la proteina nelle urine danno errori, pertanto, si consiglia di eseguire diverse analisi e quindi utilizzare la formula per calcolare il valore corretto. Il contenuto di proteine ​​nelle urine è misurato in g / le mg / l. Questi indicatori di proteine ​​rendono possibile determinare il livello di proteinuria, suggerire un motivo, valutare la prognosi e determinare la strategia.

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Per il pieno funzionamento del corpo richiede uno scambio costante tra sangue e tessuti. È possibile solo se c'è una certa pressione osmotica nei vasi sanguigni. Le proteine ​​del plasma sanguigno mantengono un tale livello di pressione, quando le sostanze a basso peso molecolare passano facilmente dal mezzo con la loro alta concentrazione al mezzo con la concentrazione più bassa. La perdita di molecole proteiche porta al rilascio di sangue dal suo letto nel tessuto, che è pieno di edema forte. Questa è la manifestazione di proteinuria moderata e grave.

Le fasi iniziali dell'albuminuria sono asintomatiche. Il paziente presta attenzione solo alle manifestazioni della malattia sottostante, che è la causa delle proteine ​​nelle urine.

La proteinuria della traccia è chiamata aumento del livello di proteine ​​nelle urine dovuto all'uso di determinati prodotti

L'urina per l'analisi viene raccolta in un contenitore pulito e scremato. Prima di raccogliere la toilette è mostrato perineo, è necessario lavare con acqua e sapone. Le donne sono avvisate di chiudere la vagina con un pezzo di cotone o un tampone in modo che lo scarico vaginale non influenzi il risultato. Alla vigilia è meglio non bere alcolici, acqua minerale, caffè, cibi piccanti, salati e alimenti che danno all'urina un colore (mirtilli, barbabietole). Forti sforzi fisici, lunghe camminate, stress, febbre e sudorazione, consumo eccessivo di cibi proteici o droghe prima di somministrare l'urina provocano la comparsa di proteine ​​nell'analisi delle urine di una persona completamente sana. Questo fenomeno ammissibile è chiamato trace proteinuria.

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Malattia renale che porta alla perdita di proteine:

• Amiloidosi. Le cellule normali nei reni sono sostituite da amiloidi (complesso proteico-saccaride), che impedisce al corpo di funzionare normalmente. Allo stadio proteinurico, gli amiloidi si depositano nei tessuti renali, distruggendo il nefrone e, di conseguenza, il filtro renale. Quindi la proteina passa dal sangue alle urine. Questa fase può durare più di 10 anni.
• Nefropatia diabetica. A causa del metabolismo improprio di carboidrati e lipidi, i vasi sanguigni, i glomeruli e i tubuli nel rene vengono distrutti. Le proteine ​​nelle urine sono il primo segno di una complicanza prevista del diabete.
• Malattie di genesi infiammatoria - nefrite. Molto spesso, le lesioni colpiscono i vasi sanguigni, i glomeruli ei sistemi pielocalicea, interrompendo il normale corso del sistema di filtrazione.
• La glomerulonefrite nella maggior parte dei casi è di natura autoimmune. Il paziente lamenta una diminuzione della quantità di urina, dolore lombare e aumento della pressione. Per il trattamento della glomerulonefrite consigliamo dieta, regime e terapia farmacologica.
• Pielonefrite. Nel periodo acuto si verifica con sintomi di infezione batterica: brividi, nausea, mal di testa. Questa è una malattia infettiva.
• Malattia del rene policistico.

In un corpo sano, le molecole proteiche (e sono di dimensioni piuttosto grandi) non sono in grado di passare attraverso il sistema di filtrazione dei reni. Pertanto, le proteine ​​nelle urine non dovrebbero essere. Questo indicatore è lo stesso per uomini e donne. Se l'analisi indica proteinuria, è importante consultare un medico per motivi. Lo specialista stimerà quanto è elevato il livello proteico, se esiste una patologia concomitante, come ripristinare il normale funzionamento del corpo. Secondo le statistiche, le donne hanno un rischio più elevato di malattia urogenitale rispetto agli uomini.

Principio del metodo basato sulla coagulazione delle proteine ​​nelle urine in presenza di acido nitrico (o soluzione al 20% di acido sulfosalicilico).

Progresso del lavoro: a 5 gocce di urina aggiungere 1-2 gocce di acido nitrico (o solfosalicilico). In presenza di proteine ​​nelle urine appare torbidità.

Tabella. Rilevazione di componenti patologici di urina.

Nota: in presenza di glucosio e proteine ​​nell'urina esaminata, viene determinato il loro contenuto quantitativo.

Principio del metodo: Complesso colorato è formato, l'intensità di colore, che è proporzionale alla concentrazione della proteina nel campione ad un'interazione proteina con pirogallolo molibdato rosso e sodio.

reagenti: Reagente di lavoro - soluzione di rosso pirogallolo in tampone succinato, soluzione proteica di calibrazione con una concentrazione di 0,50 g / l

I campioni si mescolano e rimangono per 10 minuti. a temperatura ambiente (18-25 ° C). Misurare la densità ottica del campione sperimentale (Dop) e di calibrazione (Dk) rispetto al campione di controllo a λ = 598 (578-610) nm. La colorazione è stabile per 1 ora.

calcolo: la concentrazione di proteine ​​nell'urina (C) g / l è calcolata con la formula:

dove: Dop = Dk = C = g / l.

Valori normali: fino a 0,094 g / l (0,141 g / giorno)

Principio del metodo: Quando il D-glucosio viene ossidato dall'ossigeno atmosferico sotto l'azione della glucosio ossidasi, si forma una quantità equimolare di perossido di idrogeno. Sotto l'azione della perossidasi, il perossido di idrogeno ossida i substrati cromogeni (una miscela di fenolo e 4 aminoantipirina - 4 ° P) con la formazione di un prodotto colorato. L'intensità del colore è proporzionale al contenuto di glucosio.

Glucosio + O2 + H2O gluconolattone + H2O2

2H2O2 + fenolo + composto colorato 4AAP + 4H2O

Progresso del lavoro: 1 ml della soluzione di lavoro e 0,5 ml di tampone fosfato vengono introdotti in due provette. Alla prima provetta vengono aggiunti 0,02 ml di urina e al secondo si aggiungono 0,02 ml del calibratore (calibrazione, soluzione standard di glucosio, 10 mmol / l). I campioni vengono miscelati, incubati per 15 minuti ad una temperatura di 37 ° C in un termostato e la densità ottica dei campioni sperimentali (Dop) e di calibrazione (Dk) rispetto al reagente di lavoro viene misurata ad una lunghezza d'onda di 500-546 nm.

Calcolo: C = Dop / Dk  10 mmol / l Dop = Dk =

Il contenuto di glucosio nell'urina giornaliera è determinato da mmol / die moltiplicando il risultato ottenuto dal volume di urina raccolta al giorno.

Nota. Quando il contenuto di zucchero nelle urine supera l'1% deve essere diluito.

Attualmente, i laboratori biochimici usano un metodo espresso unificato per analizzare l'urina per il glucosio usando il test del glucosio reattivo al glucosio o usando strisce reattive combinate per pH, proteine, glucosio, corpi chetonici e sangue. Strisce reattive, immerse in una nave con urina per 1 secondo. e confrontare il colore sulla scala.

Determinazione della proteina utilizzando l'indicatore rosso pirogallolo

Il principio del metodo si basa sulla misurazione fotometrica della densità ottica di una soluzione di un complesso colorato formata dall'interazione di molecole proteiche con molecole del complesso colorante rosso pirogallolo e molibdato di sodio (complesso Pyrogallol Red-Molibdato) in un mezzo acido. L'intensità del colore della soluzione è proporzionale al contenuto di proteine ​​nel materiale in esame. La presenza di detergenti nel reagente fornisce una definizione equivalente di proteine ​​di diversa natura e struttura.

Reagenti. 1) 1,5 mmol / l di pyrogallol red (PGA): 60 mg di PGA vengono sciolti in 100 ml di metanolo. Conservare a temperatura 0-5 ° С; 2) soluzione tampone di 50 mmol / l di succinato pH 2,5: 5,9 g di acido succinico (HOOC - CH2 - CH2 - COOH); 0,14 g di ossalato di sodio (Na2C2O4) e 0,5 g di sodio benzoato (C6H5COONa) vengono sciolti in 900 ml di acqua distillata; 3) soluzione di cristallo idrato di sodio molibdato 10 mmol / l (Na2MoO4 × 2H2O): 240 mg di sodio molibdato sono sciolti in 100 ml di acqua distillata; 4) Reagente di lavoro: a 900 ml di soluzione tampinata di succinato aggiungere 40 ml della soluzione di PHC e 4 ml di soluzione di molibdato di sodio. Il pH della soluzione viene regolato a 2,5 con una soluzione 0,1 mol / l di acido cloridrico (HCl) e il suo volume è regolato a 1 l. Il reagente in questa forma è pronto per l'uso ed è stabile se conservato in un luogo buio ea una temperatura di 2-25 ° C per 6 mesi; 5) Soluzione di albumina standard da 0,5 g / l.

Il corso della determinazione. Nella prima provetta vengono introdotti 0,05 ml di urina studiata, 0,05 ml di soluzione standard di albumina vengono aggiunti alla seconda provetta e 0,05 ml di acqua distillata alla terza provetta (campione di controllo), quindi a queste provette vengono aggiunti 3 ml di reagente di lavoro. Il contenuto delle provette viene miscelato e dopo 10 minuti, il campione e lo standard vengono fotomettati su un campione di controllo a una lunghezza d'onda di 596 nm in una cuvetta con una lunghezza del cammino ottico di 10 mm.

Il calcolo della concentrazione di proteine ​​nel campione di urina analizzato viene effettuato secondo la formula:

C = 0,5 × Apr / Ast,

dove C è la concentrazione di proteine ​​nel campione di urina analizzato, g / l; Apr e Ast: estinzione del campione di urina studiato e soluzione standard di albumina, g / l; 0,5 - concentrazione di soluzione di albumina standard, g / l.

• il colore della soluzione (complesso di colori) è stabile per un'ora;
• la relazione direttamente proporzionale tra la concentrazione di proteine ​​nel campione e l'assorbimento della soluzione dipende dal tipo di fotometro;
• quando il contenuto proteico nelle urine è superiore a 3 g / l, il campione viene diluito con soluzione isotonica di cloruro di sodio (9 g / l) e la determinazione viene ripetuta. Il grado di diluizione viene preso in considerazione quando si determina la concentrazione di proteine.

• Determinazione della proteina urinaria
• Prova di acido solfosalicilico unificata
• Il metodo Unified Brandberg - Roberts - Stolnikov
• Determinazione della quantità di proteine ​​nelle urine per reazione con acido sulfosalicilico
• Metodo Biuret
• Rilevazione nell'urina di Bens - Jones protein

La proteinuria è un fenomeno in cui la proteina viene rilevata nelle urine, che indica la possibilità di danno renale, serve come fattore nello sviluppo di malattie cardiache, vasi sanguigni, vasi linfatici.

La rilevazione delle proteine ​​nelle urine non sempre indica una malattia. Un fenomeno simile è tipico anche per le persone assolutamente sane, nelle cui proteine ​​urinarie possono essere rilevate. Ipotermia, sforzo fisico, consumo di alimenti proteici porta alla comparsa di proteine ​​nelle urine, che scompare senza alcun trattamento.

Al momento dello screening, il 17% delle persone sane determina le proteine, ma solo il 2% di questo numero di persone mostra un risultato positivo come segno di malattia renale.

Le molecole proteiche non dovrebbero entrare nel sangue. Sono vitali per il corpo - sono un materiale da costruzione per le cellule, partecipano a reazioni come coenzimi, ormoni, anticorpi. In entrambi gli uomini e le donne, il tasso è la completa assenza di proteine ​​nelle urine.

La funzione di prevenire la perdita di molecole proteiche da parte dell'organismo viene eseguita dai reni.

Due sistemi di reni sono coinvolti nel filtraggio delle urine:

1. glomeruli: non lasciare entrare grandi molecole, ma non tenere l'albumina, globuline - una piccola frazione di molecole proteiche;
2. tubuli renali - adsorbire le proteine ​​dai glomeruli filtrati, ritornare al sistema circolatorio.

L'albumina (circa il 49%), le mucoproteine, le globuline si trovano nelle urine, di cui la quota delle immunoglobuline rappresenta circa il 20%.

Globuline - proteine ​​del siero del latte ad alto peso molecolare, che sono prodotte nel sistema immunitario e nel fegato. Molti di questi sono sintetizzati dal sistema immunitario, si riferiscono a immunoglobuline o anticorpi.

Le albumine sono una frazione di proteine ​​che appaiono per prime nelle urine anche con danni minori ai reni. C'è una certa quantità di albumina nell'urina sana, ma è così insignificante che non può essere rilevata con la diagnostica di laboratorio.

La soglia inferiore che può essere rilevata utilizzando la diagnostica di laboratorio è 0,033 g / l. Se vengono persi più di 150 mg di proteine ​​al giorno, stanno parlando di proteinuria.

Dati di base sulle proteine ​​delle urine

La malattia con lieve proteinuria è asintomatica. Visivamente, l'urina priva di proteine ​​non può essere distinta dall'urina, in cui vi è una piccola quantità di proteine. Un'urina un po 'schiumosa diventa già con un alto grado di proteinuria.

È possibile assumere un'escrezione attiva di proteine ​​nelle urine dall'aspetto del paziente solo con un grado moderato o grave della malattia a causa della comparsa di edema degli arti, del viso, dell'addome.

Nelle prime fasi della malattia, i seguenti possono essere segni indiretti di proteinuria:

• colorazione delle urine;
• crescente debolezza;
• mancanza di appetito;
• nausea, vomito;
• dolore osseo;
• sonnolenza, vertigini;
• temperatura elevata

L'aspetto di tali segni non può essere ignorato, soprattutto durante la gravidanza. Ciò potrebbe significare una leggera deviazione dalla norma e potrebbe essere un sintomo dello sviluppo della preeclampsia, della preeclampsia.

Quantificare la perdita di proteine ​​non è un compito facile: per ottenere un quadro più completo delle condizioni del paziente, vengono utilizzati diversi test di laboratorio.

Le difficoltà nella scelta di un metodo per rilevare le proteine ​​in eccesso nelle urine sono spiegate da:

• concentrazione di proteine ​​basse, per le quali il riconoscimento richiede strumenti di alta precisione;
• composizione di urina, complicando il compito, in quanto contiene sostanze che distorcono il risultato.

La maggiore informazione è fornita dall'analisi della prima porzione mattutina di urina, che viene raccolta dopo il risveglio.

Alla vigilia dell'analisi, devono essere soddisfatte le seguenti condizioni:

• Non mangiare cibi piccanti, fritti, proteici, alcool;
• escludere il diuretico per 48 ore;
• limitare l'attività fisica;
• seguire attentamente le regole di igiene personale.

L'urina del mattino è la più informativa, poiché è a lungo termine nella vescica, meno dipendente dall'assunzione di cibo.

La quantità di proteine ​​nelle urine può essere analizzata da una porzione casuale, che viene presa in qualsiasi momento, ma questa analisi è meno informativa, maggiore è la probabilità di errore.

Per quantificare la perdita giornaliera di proteine, viene eseguita un'analisi dell'urina totale giornaliera. Per fare questo, entro 24 ore raccolte in un contenitore di plastica speciale tutte le urine assegnate per il giorno. Puoi iniziare a raccogliere in qualsiasi momento. La condizione principale - esattamente il giorno della raccolta.

La definizione qualitativa della proteinuria si basa sulla denaturazione della proteina da parte di fattori fisici o chimici. I metodi qualitativi si riferiscono allo screening, che consente di stabilire la presenza di proteine ​​nelle urine, ma non offre l'opportunità di valutare accuratamente il grado di proteinuria.

Campioni usati:

• con ebollizione;
• acido solfosalicilico;
• acido nitrico, reagente Larionico nel campione dell'anello di Heller.

Un campione con acido sulfosalicilico viene eseguito confrontando un campione di urina di controllo con un campione esperto, in cui alle urine vengono aggiunte 7-8 gocce di acido solfosalicilico al 20%. La conclusione sulla presenza della proteina viene effettuata in base all'intensità della torbidità opalescente che appare nella provetta durante la reazione.

Test Geller più usato con acido nitrico al 50%. La sensibilità del metodo è 0,033 g / l. Con una tale concentrazione di proteine ​​in una provetta con un campione di urina e un reagente per 2-3 minuti dopo l'inizio dell'esperimento, appare un anello bianco, la cui formazione indica la presenza di proteine.

I metodi semi-quantitativi includono:

• metodo per determinare la proteina nelle strisce reattive per le urine;
• Metodo Brandberg-Roberts-Stolnikov.

Il metodo di determinazione secondo il metodo Brandberg-Roberts-Stolnikov si basa sul metodo dell'anello di Geller, ma consente di stimare più accuratamente la quantità di proteine. Quando si esegue un test utilizzando questa tecnica, diverse diluizioni di urina raggiungono l'aspetto di un anello proteico simile a un filo nell'intervallo di tempo tra i 2-3 minuti dall'inizio del test.

In pratica, il metodo con striscia reattiva viene utilizzato con il colorante blu di bromofenolo applicato come indicatore. Lo svantaggio delle strisce reattive è la sensibilità selettiva all'albumina, che porta a una distorsione del risultato nel caso di un aumento della concentrazione di urine di globuline o altre proteine.

Gli svantaggi del metodo sono anche la sensibilità relativamente bassa del test alla proteina. Le strisce reattive iniziano a rispondere alla presenza di proteine ​​nelle urine ad una concentrazione proteica superiore a 0,15 g / l.

I metodi di valutazione quantitativa possono essere suddivisi in modo condizionale in:

I metodi sono basati sulla proprietà delle proteine ​​per ridurre la solubilità sotto l'azione di un agente legante con la formazione di un composto scarsamente solubile.

Gli agenti che causano il legame alle proteine ​​possono essere:

• acido solfosalicilico;
• acido tricloroacetico;
• benzetonio cloruro.

In base ai risultati dei test, le conclusioni sono tratte in base al grado di attenuazione del flusso luminoso nel campione con sospensione rispetto a quello di controllo. I risultati di questo metodo non possono sempre essere attribuiti ad affidabili a causa delle differenze nelle condizioni di: velocità di miscelazione dei reagenti, temperatura, acidità del mezzo.

L'effetto sulla valutazione dell'assunzione di farmaci il giorno prima, prima di condurre test utilizzando questi metodi, non può essere preso:

• antibiotici;
• sulfamidici;
• droghe contenenti iodio.

Il metodo si riferisce a disponibile al costo, che consente di essere ampiamente utilizzato per lo screening. Ma risultati più accurati possono essere ottenuti utilizzando tecniche colorimetriche più costose.

Metodi sensibili che determinano accuratamente la concentrazione di proteine ​​nelle urine includono metodi colorimetrici.

Puoi farlo con alta precisione:

• reazione del biureto;
• tecnica Lowry;
• Tecniche di colorazione che utilizzano coloranti che formano complessi con proteine ​​dell'urina che differiscono visivamente dal campione.

Metodi colorimetrici per la rilevazione delle proteine ​​nelle urine

Il metodo si riferisce ad un affidabile, altamente sensibile, che consente di determinare nelle urine albumina, globuline, paraproteine. È usato come il metodo principale per chiarire i risultati dei test controversi, così come la proteina giornaliera delle urine nei pazienti con reparti nefrologici degli ospedali.

Risultati ancora più accurati possono essere ottenuti con il metodo Lowry, che si basa sulla reazione del biureto, nonché sulla reazione di Folin, che riconosce il triptofano e la tirosina nelle molecole proteiche.

Per eliminare possibili errori, il campione di urina viene purificato mediante dialisi da aminoacidi, acido urico. Gli errori sono possibili quando si utilizzano salicilati, tetracicline, clorpromazina.

Il metodo più accurato per determinare una proteina si basa sulla sua proprietà di legarsi ai coloranti di cui sono utilizzati:

• ponceau;
• Coomassie blu brillante;
• rosso pirogallico.

Durante il giorno, la quantità di proteine ​​escreta nelle urine varia. Per valutare più obiettivamente la perdita di proteine ​​nelle urine, introdurre il concetto di proteine ​​giornaliere nelle urine. Questo valore è misurato in g / giorno.

Per una rapida valutazione della proteina giornaliera nelle urine, la quantità di proteine ​​e creatinina è determinata in una singola porzione di urina, quindi un rapporto proteina / creatinina viene ricavato dalla perdita di proteine ​​al giorno per il rapporto.

Il metodo si basa sul fatto che il tasso di escrezione urinaria di creatinina è costante, non cambia durante il giorno. In una persona sana, la normale proporzione di proteine: la creatinina nelle urine è 0,2.

Questo metodo elimina possibili errori che possono verificarsi quando si raccoglie l'urina giornaliera.

I test qualitativi più frequenti dei test quantitativi danno risultati falsi positivi o falsi negativi. Gli errori si presentano in relazione ai farmaci, alle abitudini alimentari, all'attività fisica alla vigilia dell'analisi.

La decodifica di questo test qualitativo è data dalla valutazione visiva della torbidità nella provetta rispetto al risultato del test con il controllo:

1. la reazione positiva debole è stimata come +;
2. positivo ++;
3. nettamente positivo +++.

Il test dell'anello di Geller valuta più accuratamente la presenza di proteine ​​nelle urine, ma non consente di quantificare la proteina nelle urine. Come per il test dell'acido solfosalicilico, il test di Geller fornisce solo un'idea approssimativa del contenuto di proteine ​​urinarie.

Il metodo consente di valutare quantitativamente il grado di proteinuria, ma richiede troppo tempo, è impreciso, poiché con una forte diluizione diminuisce l'accuratezza della valutazione.

Per calcolare la proteina, è necessario moltiplicare il grado di diluizione dell'urina di 0, 033 g / l:

Il test non richiede condizioni particolari, questa procedura è facile da fare a casa. Per fare questo, è necessario abbassare la striscia reattiva nell'urina per 2 minuti.

I risultati saranno espressi dal numero di plus sulla striscia, la cui decodifica è contenuta nella tabella:

1. I risultati del test corrispondenti a valori fino a 30 mg / 100 ml corrispondono alla proteinuria fisiologica.
2. I valori sulle strisce reattive 1+ e 2 ++ significano proteinuria significativa.
3. I valori di 3 +++, 4 ++++ sono marcati con proteinuria patologica causata da malattie renali.

Le strisce reattive possono solo determinare approssimativamente l'aumento di proteine ​​nelle urine. Non vengono utilizzati per una diagnosi accurata, e ancora di più non possono dire cosa significhi.

Non consentire alle strisce reattive di valutare adeguatamente la quantità di proteine ​​nelle urine nelle donne in gravidanza. Un metodo di valutazione più affidabile è la determinazione delle proteine ​​nell'urina quotidiana.

Determinazione della proteina urinaria mediante strisce reattive:

La proteina giornaliera nelle urine è una diagnosi più accurata della valutazione dello stato funzionale dei reni. Per questo è necessario raccogliere tutte le urine espulse dai reni al giorno.

Il contenuto proteico nelle urine può essere trovato dal rapporto delle proteine: creatinina, i dati sono mostrati nella tabella:

I valori validi per il rapporto proteine ​​/ creatinina sono i dati nella tabella:

Con la perdita di oltre 3,5 g di proteine ​​al giorno, la condizione è chiamata proteinuria massiva.

Se c'è molta proteina nelle urine, è necessario un riesame dopo 1 mese, quindi dopo 3 mesi, in base ai risultati, che stabiliscono il motivo per cui la norma viene superata.

Le cause dell'aumento delle proteine ​​nelle urine sono l'aumento della produzione nel corpo e la violazione dei reni, che distingue la proteinuria:

• fisiologico - le deviazioni minori dalla norma sono causate da processi fisiologici, risolti spontaneamente;
• patologico - i cambiamenti sono causati come conseguenza del processo patologico nei reni o in altri organi del corpo, senza che il trattamento progredisca.

Un leggero aumento delle proteine ​​può essere osservato con un'abbondante nutrizione proteica, ustioni meccaniche, lesioni, accompagnata da un aumento della produzione di immunoglobuline.

Una leggera proteinuria può essere causata dallo sforzo fisico, dallo stress psico-emotivo o dall'assunzione di determinati farmaci.

La proteinuria fisiologica è un aumento delle proteine ​​urinarie nei bambini nei primi giorni dopo la nascita. Ma dopo una settimana di vita, il contenuto proteico nelle urine di un bambino è considerato come una deviazione dalla norma e indica una patologia in via di sviluppo.

Malattie renali, le malattie infettive sono talvolta accompagnate dalla comparsa di proteine ​​nelle urine.

Tali stati di solito corrispondono a un lieve grado di proteinuria, sono fenomeni transitori, passano rapidamente da soli, senza richiedere un trattamento speciale.

Condizioni più gravi, grave proteinuria si nota nel caso di:

• glomerulonefrite;
• diabete;
• malattie cardiache;
• cancro alla vescica;
• mieloma multiplo;
• infezione, danno da farmaci, malattia del rene policistico;
• ipertensione;
• lupus eritematoso sistemico;
• Sindrome di Goodpasture.

Ostruzione intestinale, insufficienza cardiaca e ipertiroidismo possono causare tracce di proteine ​​nelle urine.

Le varietà di proteinuria sono classificate in diversi modi. Per una valutazione qualitativa delle proteine, si può usare la classificazione Yaroshevsky.

Secondo la sistematica di Yaroshevsky, creata nel 1971, si distingue la proteinuria:

1. renale - che include la violazione della filtrazione glomerulare, il rilascio di proteine ​​dei tubuli, la mancanza di ri-adsorbimento delle proteine ​​nei tubuli;
2. prerenale - si verifica al di fuori dei reni, escrezione di emoglobina, proteine ​​che si verificano in eccesso nel sangue a causa del mieloma multiplo;
3. Postrenal - si verifica nel sito delle vie urinarie dopo i reni, l'escrezione di proteine ​​nella distruzione degli organi urinari.

Per una valutazione quantitativa di ciò che sta accadendo, i gradi di proteinuria condizionatamente sono isolati. Va ricordato che possono facilmente passare a uno più pesante senza trattamento.

La fase più grave della proteinuria si sviluppa con la perdita di oltre 3 g di proteine ​​al giorno. La perdita di proteine ​​da 30 mg a 300 mg al giorno corrisponde allo stadio moderato o alla microalbumuria. Fino a 30 mg di proteine ​​nelle urine quotidiane indicano una lieve proteinuria.

Norma proteica nelle urine quanto?

La normale proteina nelle urine è praticamente assente (meno di 0,002 g / l). Tuttavia, in alcune condizioni, una piccola quantità di proteine ​​può comparire nelle urine in individui sani dopo l'ingestione di una grande quantità di alimenti proteici, come risultato del raffreddamento, dello stress emotivo, dello sforzo fisico prolungato (la cosiddetta proteinuria marcia).

L'aspetto di una quantità significativa di proteine ​​nelle urine (proteinuria) è una patologia. La causa della proteinuria può essere una malattia renale (glomerulonefrite acuta e cronica, pielonefrite, nefropatia gravida, ecc.) O delle vie urinarie (infiammazione della vescica, prostata, ureteri). La proteinuria renale può essere organica (glomerulare, tubulare e in eccesso) e funzionale (proteinuria febbrile, ortostatica negli adolescenti, quando i neonati sono ipernutriti, nei neonati). La proteinuria funzionale non è associata alla patologia renale. La quantità giornaliera di proteine ​​varia nei pazienti da 0,1 a 3,0 go più. La composizione delle proteine ​​delle urine è determinata mediante elettroforesi. L'aspetto nelle urine della proteina Bens-Jones è caratteristico del mieloma e della macroglobulinemia di Waldenstrom, 223, 2 microglobuline in caso di danno ai tubuli renali.

La normale proteina nelle urine è praticamente assente (meno di 0,002 g / l).

I principali segni di malattia rilevati nello studio delle urine.

Peso specifico SG. Una diminuzione del peso specifico indica una diminuzione della capacità dei reni di concentrare l'urina ed espellere le tossine dal corpo, come nel caso dell'insufficienza renale. L'aumento del peso specifico è associato a una grande quantità di zucchero nelle urine e nei sali. Va notato che è impossibile valutare il peso specifico per un solo test delle urine, ci possono essere cambiamenti casuali, è necessario ripetere 1-2 analisi delle urine.

Proteine ​​Proteine ​​nelle urine - proteinuria. La causa della proteinuria può essere il danno ai reni stessi nella nefrite, l'amiloidosi e il danno da veleni. Le proteine ​​nelle urine possono anche apparire a causa di malattie del tratto urinario (pielonefrite, cistite, prostatite).

Glucosio glucosio (zucchero) nelle urine - glicosuria - più spesso a causa del diabete. Una causa più rara è la sconfitta dei tubuli renali. È molto inquietante se i corpi chetonici vengono rilevati insieme allo zucchero nelle urine. Questo accade con il diabete severo e disallineato ed è un precursore delle più gravi complicanze del diabete - coma diabetico.

Bilirubina, Urobilinogen Bilirubin e urobilin sono determinati nelle urine in varie forme di ittero.

Eritrociti Eritrociti nelle urine - ematuria. Ciò accade sia con la sconfitta dei reni stessi, il più delle volte con la loro infiammazione, o in pazienti con malattie del tratto urinario. Se, per esempio, una pietra si muove lungo di loro, può ferire la mucosa, ci saranno globuli rossi nelle urine. Un tumore renale in decomposizione può anche portare a ematuria.

Leucociti Leucociti nelle urine - leucocituria, il più delle volte il risultato di alterazioni infiammatorie delle vie urinarie in pazienti con pielonefrite, cistite. I leucociti sono spesso determinati dall'infiammazione degli organi genitali esterni femminili, negli uomini, dall'infiammazione della ghiandola prostatica.

Cilindri I cilindri sono strutture microscopiche peculiari. I cilindri ialini nella quantità di 1-2 possono essere in una persona sana. Sono formati nei tubuli renali, sono attaccati insieme alle particelle proteiche. Ma l'aumento del loro numero, cilindri di altri tipi (granulari, eritrocitari, grassi) indicano sempre il danno del tessuto renale stesso. Ci sono i cilindri nelle malattie infiammatorie dei reni, le lesioni metaboliche, come il diabete.

Metodo informativo e suoi limiti. Il contenuto informativo del test generale delle urine per il riconoscimento di specifiche malattie dei reni è basso, di solito richiede ulteriori studi più accurati. Ma la ricerca è molto importante, soprattutto quando si effettuano studi preventivi, in quanto consente di identificare i primi segni di malattia renale. È anche noto che spesso le malattie renali si verificano nascoste e solo uno studio delle urine consente loro di sospettare e condurre ulteriori esami necessari.

Nella maggior parte dei laboratori, quando si esamina l'urina per proteine, utilizzare prima le reazioni qualitative che non rilevano le proteine ​​nelle urine di una persona sana. Se la proteina nelle urine viene rilevata da reazioni qualitative, viene eseguita una determinazione quantitativa (o semi-quantitativa). Allo stesso tempo, le caratteristiche dei metodi usati che coprono un diverso spettro di uroproteine ​​sono importanti. Così, nella determinazione di una proteina con acido salicilsolfonico 3%, la quantità normale di proteine ​​è considerata 0,03 g / l, utilizzando il metodo pirogallolo, i valori limite della normale proteina è aumentata a 0,1 g / l. A questo proposito, nel modulo di analisi è necessario indicare il valore normale della proteina per il metodo utilizzato dal laboratorio.

Quando si determinano le quantità minime di proteine, si consiglia di ripetere l'analisi, in caso di dubbio, si dovrebbe determinare la perdita giornaliera di proteine ​​nelle urine. L'urina giornaliera normale contiene proteine ​​in piccole quantità. In condizioni fisiologiche, la proteina filtrata viene quasi completamente riassorbita dall'epitelio dei tubuli prossimali e il suo contenuto nella quantità giornaliera di urina varia in base a diversi autori da tracce fino a 20 50, 80 100 mg e persino fino a 150 200 mg. Alcuni autori ritengono che l'escrezione giornaliera di proteine ​​nella quantità di 30 50 mg / giorno sia la norma fisiologica per un adulto. Altri ritengono che l'escrezione di proteine ​​urinarie non superi i 60 mg / m2 di superficie corporea al giorno, escluso il primo mese di vita, quando il valore della proteinuria fisiologica può essere quattro volte superiore ai valori specificati.

La condizione generale per la comparsa di proteine ​​nelle urine di una persona sana è la loro concentrazione piuttosto alta nel sangue e il peso molecolare di non più di 100.200 kDa.

questa non è la norma, con la tua diagnosi è possibile, un'altra cosa è che per la sindrome nefrosica è in realtà un piccolo indicatore.. guarda la clinica - gonfiore, pressione, ecc., continua a prendere il trattamento prescritto..

eppure dirò: è normale che NON lo sia!